培養細胞系を用いたWnt/Winglessシグナル伝達経路の生化学的解析

使用培养细胞系对 Wnt/Wingless 信号通路进行生化分析

基本信息

批准号：
12026215
负责人：
柳川伸一
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12026215/
关键词：
Wnt Wingless Casein Kinase I Signal transduction Drosophila RNAi

项目摘要

形態形成にかかわるシグナル分子Wnt/Wingless(Wg)の生物活性については、様々なモデル動物を用いて分子生物学的研究がなされいる。また各種のWntシグナル伝達異常によって引き起こされたβ-cateninの蓄積が細胞のの癌化の原因となっている事も知られている。本研究の目的は、Wnt/Wgに感受性を持つDrosophilaや哺乳動物の培養細胞と、可溶性のWnt/Wg蛋白を用いて、Wnt/Wgシグナル伝達に関わる遺伝子産物の生化学的相互作用の実体を解明する事である。最近Xenopus胚を用いた解析から、Casein kinase I(CKI)が、Wntシグナル伝達の正の制御因子であるとの報告がなされたが、その普遍性は他の動物系を用いて、検証されているわけではなかった。そこで、本研究ではDrosophilaの系を用いて、CKIのWgシグナル伝達経路における役割の解析を行った。Schneider S2R+細胞をDrosophilaのCKIα及びεのdouble stranded RNA(dsRNA)の存在下で培養するin vitro RNAi法を行って、CKIα及びε蛋白の産生を阻止した。するとXenopus胚を用いた結果に反し、著しいArmadillo(Arm)蛋白質の蓄積が生じた。なおRNAiによってArmのmRNAの変化は認められない事からCKIα及びε、はArm蛋白質の安定性を負に制御していることが明らかとなった。さらにDrosophilaの胚に同じdsRNAを注入して、胚におけるCKI蛋白の産生を阻止したところ、Wgシグナルが過剰に流れた事を意味するNaked cuticleの表現型を持つ胚が発生した。これらの結果は、Drosophilaでは、CKIはWgシグナル伝達の負の制御因子として働いている事を示すものであった。

使用各种模型动物对参与形态发生的信号分子 Wnt/Wingless (Wg) 的生物活性进行了分子生物学研究。还已知，各种Wnt信号传导异常引起的β-连环蛋白的积累是细胞癌变的原因。本研究的目的是利用对Wnt/Wg和可溶性Wnt/Wg蛋白敏感的果蝇和哺乳动物的培养细胞来研究参与Wnt/Wg信号转导的基因产物的生化相互作用。最近，利用非洲爪蟾胚胎进行的分析表明，酪蛋白激酶 I (CKI) 是 Wnt 信号传导的正调节因子，但其普遍性尚未通过其他动物系统得到验证。因此，本研究利用果蝇系统分析CKI在Wg信号通路中的作用。我们进行了体外 RNAi 方法，其中在果蝇 CKIα 和 ε 双链 RNA (dsRNA) 存在的情况下培养 Schneider S2R+ 细胞，以阻断 CKIα 和 ε 蛋白的产生。与非洲爪蟾胚胎的结果相反，犰狳（Arm）蛋白发生显着积累。此外，由于RNAi没有观察到Arm mRNA的变化，因此很明显CKIα和ε负向调节Arm蛋白的稳定性。此外，当他们将相同的 dsRNA 注射到果蝇胚胎中以阻止胚胎中 CKI 蛋白的产生时，胚胎发育出裸角质层表型，这意味着 Wg 信号流过多。这些结果表明 CKI 在果蝇中充当 Wg 信号传导的负调节因子。