GD3合成酵素遺伝子により誘導される細胞増殖シグナルの分子機構

GD3合酶基因诱导细胞增殖信号的分子机制

• 批准号: 11139228
• 负责人: 古川 鋼一
• 金额: $ 2.56万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11139228/
• 关键词: ガングリオシド; メラノーマ; 細胞増殖; シグナル; GD3; 糖転移酵素

本研究ではヒトのメラノーマ細胞、PC12細胞などを用いて、GD3合成酵素遺伝子の操作による糖鎖リモデリングを行い、GD3発現によって誘導される細胞増殖亢進の分子機構の解明を目ざした。(1)GD3合成酵素遺伝子を導入したPC12細胞における細胞内シグナル分子の変化を検討した。これらの遺伝子導入細胞ではTrkA、MAPキナーゼが恒常的に活性化しており、NGFの刺激前も刺激後120分も全く変化しなかった。更にクロスリンキング法による二量体形成の有無の検討を行ったところ、全ての遺伝子導入・発現細胞においてNGF刺激に関係なく二量体bandが検出された。コントロールでは刺激後のみに二量体bandを認めた。(2)GD3合成酵素遺伝子の発現を抑制するために、cDNAの全長又は2種の部分配列を逆方向に発現ベクターに挿入したアンチセンスcDNAベクターを作成し、各々の変異細胞株を樹立した。最短のアンチセンス導入細胞を除いて、GD3発現レベルが約5分の1に低下すると共に、細胞増殖度が約2分の1に低下した。(3)ヒト培養メラノサイトに対し、メラノサイトにGD3合成酵素遺伝子を安定発現させ、その形質変化を観察した。細胞が紡錘型から上皮型に形態変化し突起の短縮を認めたが、増殖度には変化を認めなかった。(4)ヒトメラノーマ細胞株MeWoの培養液中に抗GD3抗体R24を添加したところ、約10μg/mlの濃度で著明な増殖抑制が認められた。同時にPI染色で細胞死が認められ、GD3を介する細胞死の誘導が示された。ガングリオシド糖鎖による増殖因子受容体のmodulationについては以前から提唱されてきたが、今回、TrkAの恒常的リン酸化と二量体形成など、化学構造上の変化が、糖鎖変化により惹起されることが初めて示された。また、今回示されたメラノーマ細胞におけるGD3発現レベルと増殖度の相関や、抗GD3抗体による培養メラノーマの増殖抑制効果はGD3の役割を再認識させるものであり、現在、抗体による増殖抑制の分子機序を解明中である。

在这项研究中，使用人黑色素瘤细胞，PC12细胞等进行聚糖重塑，通过操纵GD3合酶基因，旨在阐明由GD3表达诱导的细胞增殖增加的分子机制。 （1）我们研究了用GD3合酶基因转移的PC12细胞中细胞内信号分子的变化。 TRKA和MAP激酶在这些转基因细胞中被组成式激活，并且在NGF刺激之前或之后未进行任何变化。此外，当我们研究是否通过交联是否进行二聚体形成时，无论NGF刺激如何，在所有基因转染和表达的细胞中都检测到二聚体带。在对照组中，仅在刺激后观察到二聚体带。 （2）为了抑制GD3合酶基因的表达，创建了一个反义cDNA载体，其中将cDNA的全长或两个子序列插入在反向方向上，并建立每个突变细胞系。除最短的反义诱导细胞外，GD3表达水平降低了约1/5，细胞增殖降低了约1/2。 （3）GD3合酶基因在人培养的黑素细胞中稳定地表达在黑素细胞上，并且观察到特征的变化。细胞从纺锤形变为上皮形变化，缩短了突出，但没有观察到增殖程度的变化。 （4）将抗GD3抗体R24添加到人类黑色素瘤细胞系MEWO的培养基中时，在约10μg/ml的浓度下观察到显着的生长抑制作用。同时，PI染色显示细胞死亡，表明GD3介导的细胞死亡诱导。已经提出了一段时间以神经节苷脂糖对生长因子受体的调节，但是现在首次证明了化学结构的变化，例如TRKA和二聚体形成的组成型磷酸化，是由聚糖变化诱导的。此外，此处已显示的黑色素瘤细胞中GD3表达水平与增殖水平之间的相关性以及抗GD3抗体在培养的黑色素瘤中的生长抑制作用正在重申GD3的作用，并且目前澄清了抗体诱导的生长抑制作用的分子机制。