速い潜在致死障害修復の分子的基礎(Ku80/Ku70の役割)

快速潜在致命损伤修复的分子基础（Ku80/Ku70的作用）

基本信息

批准号：
10878082
负责人：
内海博司
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10878082/
关键词：
Ku70とKu80複合体 DNA二重鎖切断潜在性致死損傷

项目摘要

申請者らは、過去数年来、電離放射線の潜在性致死損傷(PLD:potentlally lethai damage)の修復について研究してきた。そして、従来の修復速度の遅いPLD修復とは大きく異なり、高イオン強度で阻害される修復速度の速いPLDが存在することを見いだした。最近、高等動物細胞おいて電離放射線のDNA2重鎖切断の修復には少なくとも2種類(RAD54複合体が関与する相同組換修復とDNA-PKcs、Ku70とKu80複合体が関与する非相同組換末端結合修復)あることが明らかになった。このDNA-PK複合体はイオン強度に敏感で、0.15M NaCl中では安定であるが、0,35M NaCl以上の高塩濃度中ではDNAの2重鎖切断端から遊離することが報告されている。最近、DNA-PK活性の無いSCID細胞では、このPLD修復を保持していることが報告された。そこで、イオン強度の変化によってDNA-PK複合体が解離することによって、DNA2重鎖切断修復が阻害され、速いPLD修復が阻害されると推論した。また、高等動物細胞おいて2重鎖DNA障害修復遺伝子群が分離され、その遺伝子をノックアウトした細胞やマウスが作られ、その細胞が消失した機能を解析することが可能になった。特に、DT40というニワトリBリンパ球細胞株から、既に放射線による細胞死のターゲットと考えられるDNA二重鎖切断の修復酵素群(相同組換えや非相同組換えの遺伝子群)をノックアウトした変異細胞(KU70^<-/->やRAD54^<-/->)や高感受性のダブルノックアウト変異細胞(KU70^<-/->/RAD54^<-/->)が作られ、放射線感受性や細胞周期の研究がなされている。この細胞群を用いれば、本目的の研究が達成されるとして検討した。ニワトリBリンパ球DT40細胞株及び、この細胞株のDNA2重鎖切断の修復酵素群である相同組換修復酵素であるRAD54をノックアウトした放射線感受性細胞株(RAD54^<-/->)、非相同組換末端結合修復の遺伝子であるKU70をノックアウトした放射線感受性の変異細胞株(KU70^<-/->)、そしてこの両修復系の遺伝子をダブルノックアウト高感受性の変異細胞株(KU70^<-/->/RAD54^<-/->)を用いて、X線照射後直ちに、高張塩緩衝溶液(0.5M NaCl/PBS)で20分間処理した細胞と、しない細胞の生存率の差を検討した。結果は、親株のDT40細胞とKU70^<-/->では、高張塩緩衝溶液でX線感受性になったが、RAD54^<-/->とKU70^<-/->/RAD54^<-/->は、感受性にはならなかった。この結果は、予想と反して、RAD54複合体が支配する相同組換修復酵素系が高張塩緩衝溶液で阻害されることが明らかになった。細胞周期に及ぼす高張塩緩衝溶液での感受性の変化はGl期でなくS期であったことから、考えると相同組換修復がS期依存性であることから、矛盾は無いのかも知れない。

在过去的几年中，申请人一直在研究维修电离辐射的有效莱海伊损伤（PLD）。我们还发现，有高维修速度的PLD受高离子强度抑制的PLD，这与缓慢修复速度的常规PLD维修截然不同。最近，已经揭示了DNA双链断裂至少两种类型的修复在较高动物细胞中的电离辐射中（涉及涉及DNA-PKC的RAD54复合物和非同源重组终末键修复的同源重组修复，涉及DNA-PKC，以及KU70和KU70和KU80复合物）。该DNA-PK复合物对离子强度敏感，在0.15m的NaCl中稳定，但据报道，在高于035万NaCl的高盐浓度下，DNA的双链端释放。最近，据报道，没有DNA-PK活性的SCID细胞保留了这种PLD修复。因此，我们推断出DNA-PK复合物因离子强度的变化而解离，从而抑制DNA双链断裂修复并抑制快速PLD修复。此外，在较高的动物细胞中分离了双链DNA损伤修复基因基因，并产生了敲除基因的细胞或小鼠，从而可以分析消失的细胞的功能。特别是，突变细胞（Ku70^< - / - >和rad54^<-/ - >）和高度敏感的双基因敲除突变细胞（Ku70^< - / - >/rad54^<-/ - >）已从鸡B淋巴细胞细胞系中产生，称为DT40，这已经是dt40的靶标，这是基因组的靶标（基因组合），或者是基因组的靶标（或不合同）。已经研究了放射敏性和细胞周期。据认为，使用此细胞组将允许研究此目的。 X射线照射后用高渗盐缓冲溶液（0.5m NaCl/PBS）处理的细胞之间的存活率差异使用X射线照射后20分钟，使用放射性敏感细胞系（RAD54^<-/ - >），这是一种同源重组的修复酶，该酶是从该单元格的DNA双键线突变，该酶的突变，该酶的距非同源重组终端结合修复（KU70^< - / - >）的基因，以及一个突变细胞系，该突变细胞系从两个修复系统的基因中双重敲除。结果表明，亲本的DT40细胞和ku70^< - / - >在高渗盐缓冲溶液中对X射线敏感，而RAD54^< - / - >和KU70^< - / - >/ - >/rad54^< - / - >不易感。与期望相反，该结果表明，由Rad54复合物主导的同源重组修复酶系统受到高渗盐缓冲溶液的抑制。由于细胞周期上高渗盐缓冲溶液的灵敏度的变化是在S相而不是GL相的位置，因此考虑到这一点时可能没有矛盾，因为同源重组修复是S相依赖性的。