グラム陰性菌表層のリポ多糖(LPS)による単球・マクロファージの活性化機構

革兰氏阴性菌表面脂多糖（LPS）激活单核细胞和巨噬细胞的机制

基本信息

批准号：
10178211
负责人：
牟田達史
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

単球・マクロファージ細胞膜上のCDl4はグラム陰性菌の外膜に存在するリポ多糖(LPS)を初め、peptidoglycanなどの他の感染菌由来の物質、さらにはアポトーシスを起こした自己の不要な細胞を認識し、細胞の活性化を仲介する“pattern recognition receptor"であり、異物認識の鍵を握る分子と言える。今回我々は、CD14を介した異物認識機構を分子レベルで解明するため、メタノール資化性酵母Pichia pastorisを用いた可溶型ヒトCD14の発現系を構築し、その精製を行った。まず、glycosylphosphatidylinositol(GPI)-anchor型膜結合シグナルとなる8アミノ酸を欠損したヒト可溶型CD14をコードするcDNAを、P.pastorisゲノム内のalcohol oxidase 1(AOX1)遺伝子プロモーターの下流に酸性フオスファターゼ(PHO1)の分泌シグナルとともに相同組み換えにより導入した。得られたtransformantをメタノールを唯一の炭素源として含む培地中で培養することにより発現誘導したところ、培養上清中に分子量55kDaと51kDaの可溶型CD14の発現が認められた。組み換え可溶型CDl4(_<rs>CD14)は、培養上清を硫安沈澱によって濃縮した後、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。精製_<rs>CDl4とLPSの結合をnativc PAGEによるgel shift法で検討したところ、LPSの存在下で_<rs>CDl4の移動度が変化し、実際に複合体を形成することが確認された。今後、CD14のLPS結合における構造機能相関について解析するとともに、他の感染菌由来物質、アポトーシス細胞の認識における特異性について検討する予定である。

CDl4 on the monocyte and macrophage cell membrane is a "pattern recognition receptor" that recognizes lipopolysaccharide (LPS) present in the outer membrane of gram-negative bacteria, as well as other substances derived from infectious bacteria such as petidoglycan, as well as unwanted cells of the self that have undergone apoptosis and mediates cell activation, and can be said to be a具有外国体内识别的关键的分子。在本文中，我们使用甲醇辅助的酵母pichia Pastoris构建了一个用于可溶性人CD14的表达系统，并将其纯化以通过CD14阐明异物识别的机制。首先，一个编码人类可溶性CD14的cDNA，它在8种氨基酸中不足，该氨基酸是一种糖基磷脂酰肌醇（GPI） - 植酸型膜膜结合信号，通过酸氧化酶1（AOOX1）基因组的促进者的酸性促进者在酸性基因组中引入了酸性促进者，并将其与圣诞节的基因组进行了分泌，并将其引入。（pho1）。当将所得的转化剂培养在含有甲醇作为唯一碳源的培养基中时，在培养上清液中观察到可溶性CD14的分子量为55 kDa和51 kDa的表达。通过硫酸铵沉淀浓缩培养上清液后，通过离子交换色谱法纯化重组可溶性CDL4（_ <rs> CD14）。当使用NATIVC页面研究纯化的CDL4和LPS的结合时，证实CDL4的迁移率在LPS存在的情况下发生了变化，并且该复合物实际上形成了。将来，我们将分析CD14的LPS结合中的结构功能相关性，并研究以识别其他传染性细菌衍生的物质和凋亡细胞的特异性。