自然免疫系の活性化におけるシャペロンの機能

伴侣在激活先天免疫系统中的功能

基本信息

批准号：
14037252
负责人：
牟田達史
金额：
$ 1.86万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

自然免疫系を活性化することが近年報告されたシャペロンタンパク質の一種である熱ショックタンパク質(Hsp)60について、その構造機能相関を明らかにすることを目的に、以下の実験を行った。まず、Hsp60の野生型に加え、ATP結合部位、基質結合部位にそれぞれ変異をもつD111K、L283S変異体を作成し、大腸菌を用いた発現系を構築した。アミノ末端側に人為的に付加したHis-tagを用いて精製し、マクロファージの刺激活性についてNF-κB活性を指標に測定したところ、いずれの変異体を用いた場合にも刺激活性が検出された。大腸菌由来の何らかの自然免疫系活性化物質の微量混入の可能性が考えられたため、さらにイオン交換クロマトグラフィーによる精製を試みたが、同様に変異体においても活性が検出された。次に細菌由来の物質の混入の可能性を防ぐため、バキュロウイルスと昆虫細胞を用いた発現系を構築した。大腸菌の発現系の場合と同じく、付加したHis-tagによって精製した標品の活性を測定したところ、この系では、野生型Hsp60にもマクロファージ刺激活性は検出できなかった。これらの結果は、これまで報告されている組換えHsp60のもつ自然免疫系刺激活性は、発現に用いた大腸菌由来の物質に依存していた可能性を示唆している。一方、His-tagを含むHsp60はそのシャペロン活性発現に重要な14量体形成ができないといわれていることから、最近、tagを除去したネイティブなHsp60の昆虫細胞発現系を構築した。現在までに、細胞の粗抽出液を用いてマクロファージ刺激活性を測定したが、活性は検出されなかった。今後、さらにこの昆虫細胞で発現したHsp60を精製し、ATPase活性を確認しつつ、自然免疫系刺激活性について検討したい。また、同じく昆虫細胞発現系を構築したHsp70、90を用いて、細胞刺激活性について検討したい。

进行了以下实验，以阐明热休克蛋白（HSP）60的结构和功能相关性，这是一种近年来激活先天免疫系统的伴侣蛋白的一种伴侣蛋白。首先，除了在ATP结合位点和底物结合位点具有突变的HSP60的野生类型，D111K和L283S突变体还制备了，并使用大肠杆菌构建了表达系统。使用人工添加到氨基末端的HIS标签纯化巨噬细胞的刺激活性，当将NF-κB活性测量为指数时，使用任何突变体时检测到刺激活性。由于认为可能会从大肠杆菌中对某些先天免疫系统激活剂进行痕量污染，因此通过离子交换色谱进一步尝试了纯化，但在突变体中也检测到了活性。接下来，为了防止细菌衍生物质污染的可能性，建立了使用杆状病毒和昆虫细胞的表达系统。与大肠杆菌表达系统一样，测量了使用添加的HIS标签的纯化制剂的活性，并且在该系统中无法检测到野生型HSP60中未检测到巨噬细胞刺激活性。这些结果表明，先前报道的先天免疫系统刺激重组HSP60的活性可能取决于用于表达的大肠杆菌衍生物质。另一方面，由于包含HIS标签的HSP60无法形成14多人，这对于其伴侣活动很重要，因此我们最近构建了HSP60的天然昆虫细胞表达系统，该系统已从标签中删除。迄今为止，使用粗细细胞提取物测量了巨噬细胞刺激活性，但未检测到活性。将来，我们想进一步完善在昆虫细胞中表达的HSP60，确认ATPase活性，并检查先天免疫系统刺激活性。此外，我们想使用HSP70和90研究细胞刺激活性，这些细胞也已被构造为昆虫细胞表达系统。