自然免疫系の活性化におけるシャペロンの機能

伴侣在激活先天免疫系统中的功能

基本信息

批准号：
14037252
负责人：
牟田達史
金额：
$ 1.86万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

自然免疫系を活性化することが近年報告されたシャペロンタンパク質の一種である熱ショックタンパク質(Hsp)60について、その構造機能相関を明らかにすることを目的に、以下の実験を行った。まず、Hsp60の野生型に加え、ATP結合部位、基質結合部位にそれぞれ変異をもつD111K、L283S変異体を作成し、大腸菌を用いた発現系を構築した。アミノ末端側に人為的に付加したHis-tagを用いて精製し、マクロファージの刺激活性についてNF-κB活性を指標に測定したところ、いずれの変異体を用いた場合にも刺激活性が検出された。大腸菌由来の何らかの自然免疫系活性化物質の微量混入の可能性が考えられたため、さらにイオン交換クロマトグラフィーによる精製を試みたが、同様に変異体においても活性が検出された。次に細菌由来の物質の混入の可能性を防ぐため、バキュロウイルスと昆虫細胞を用いた発現系を構築した。大腸菌の発現系の場合と同じく、付加したHis-tagによって精製した標品の活性を測定したところ、この系では、野生型Hsp60にもマクロファージ刺激活性は検出できなかった。これらの結果は、これまで報告されている組換えHsp60のもつ自然免疫系刺激活性は、発現に用いた大腸菌由来の物質に依存していた可能性を示唆している。一方、His-tagを含むHsp60はそのシャペロン活性発現に重要な14量体形成ができないといわれていることから、最近、tagを除去したネイティブなHsp60の昆虫細胞発現系を構築した。現在までに、細胞の粗抽出液を用いてマクロファージ刺激活性を測定したが、活性は検出されなかった。今後、さらにこの昆虫細胞で発現したHsp60を精製し、ATPase活性を確認しつつ、自然免疫系刺激活性について検討したい。また、同じく昆虫細胞発現系を構築したHsp70、90を用いて、細胞刺激活性について検討したい。

进行以下实验是为了阐明热休克蛋白 (Hsp) 60 的结构-功能关系，热休克蛋白 60 是一种伴侣蛋白，最近被报道可以激活先天免疫系统。首先，除了野生型Hsp60之外，我们还分别创建了ATP结合位点和底物结合位点发生突变的D111K和L283S突变体，并使用大肠杆菌构建了表达系统。当使用人工添加到氨基末端侧的His标签进行纯化并以NF-κB活性作为指标测量巨噬细胞刺激活性时，在所有突变体中均检测到刺激活性。由于认为可能存在微量的某种源自大肠杆菌的先天免疫系统激活物质，因此尝试通过离子交换层析进一步纯化，但在突变体中也检测到类似的活性。接下来，为了防止细菌物质污染的可能性，我们使用杆状病毒和昆虫细胞构建了表达系统。与大肠杆菌表达系统的情况相同，当测量添加了His标签的纯化制剂的活性时，即使在该系统中使用野生型Hsp60也没有检测到巨噬细胞刺激活性。这些结果表明，迄今为止报道的重组Hsp60的先天免疫系统刺激活性可能取决于用于表达的大肠杆菌衍生物质。另一方面，由于含有 His 标签的 Hsp60 据说无法形成 14 聚体，这对于表达其伴侣活性很重要，因此我们最近构建了一个去除标签的天然 Hsp60 昆虫细胞表达系统。迄今为止，已使用粗细胞提取物测量了巨噬细胞刺激活性，但未检测到活性。未来，我们希望进一步纯化这些昆虫细胞中表达的Hsp60，确认其ATP酶活性，并检查其先天免疫系统刺激活性。我们还想使用 Hsp70 和 Hsp90 检查细胞刺激活性，为此我们还构建了昆虫细胞表达系统。