異物応答型プロテアーゼ前駆体の活性化機構

异物响应蛋白酶前体的激活机制

基本信息

批准号：
08278223
负责人：
牟田達史
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Factor Gサブユニットα全体と、各ドメインについて組み替え体を調製し、その多糖結合活性について検討したところ、サブユニットα全体は(1→3)-β-D-glucan、あるいは(1→4)-β-D-xylanを固定したSepharoseに結合し、mannan-Sepharose及び対照のSepharoseには結合しなかった。一方、glucanse様ドメイン、xylanase A様ドメインは上記の4種のSepharoseいずれにも結合しなかったのに対し、xylanase Z様ドメインは(1→3)-β-D-glucan-Sepharoseに特異的に結合した。すなわち、サブユニットα内のC末端に存在するxylanase Z様の2回の繰り返しドメインがFactor Gの(1→3)-β-D-glucan結合部位であることが判明した。Factor Gは異なる遺伝子に由来する2つのサブユニットから構成されているので、血球中に両者が常に会合した状態で存在するのか、あるいは解離した分子種も存在するのかを明らかにするため、それぞれのサブユニットに特異的な抗体を用いてWestern blottingにより解析した。ヘモリンフプラズマ、血球抽出液、さらに血球より分離した大・小顆粒成分に対してWestern blottingを行った結果、サブユニットα、βはいずれも細胞内大顆粒に局在することが明らかになった。また、大顆粒成分中には抗サブユニットβ抗体と反応するサブユニットβとは異なる27kDaのタンパク質の存在が見い出され、このタンパク質を精製し、cDNA cloningを行い、構造決定したところ、proline cis-trans isomerase(PPIase)活性をもつサイクロフィリンB homologueであることが明らかになった。一方、血球抽出液をDextran Sulphate-Sepharose CL-6Bによって粗分画した画分を用いて同様の解析を行ったところ、Factor Gが含まれる0.25M Nacl溶出画分には、サブユニットα、β両者の存在が確認された。また、サブユニットαは、素通り画分にも検出された。この画分にはサブユニットβは検出されず、従ってサブユニットαが単独あるいは他のタンパク質と会合した状態で存在する可能性が示唆された。

当我们制备整个G因子α亚基和每个结构域的重组体并检查其多糖结合活性时，我们发现整个G因子α亚基要么是(1→3)-β-D-葡聚糖，要么是(1→4)-它与固定有β-D-木聚糖的琼脂糖凝胶结合，但不与甘露聚糖-琼脂糖凝胶或对照琼脂糖凝胶结合。另一方面，葡聚糖酶样结构域和木聚糖酶A样结构域不与上述四种类型的琼脂糖凝胶中的任何一种结合，而木聚糖酶Z样结构域特异性结合(1→3)-β-D-葡聚糖-琼脂糖凝胶。即，揭示了存在于α亚基C末端的木聚糖酶Z样两个重复结构域是G因子的(1→3)-β-D-葡聚糖结合位点。 G因子由源自不同基因的两个亚基组成，因此为了弄清楚两个亚基是否始终以关联状态存在于血细胞中或者是否也存在解离的分子种类，我们使用亚基特异性抗体通过Western blotting进行了分析。对血淋巴血浆、血细胞提取物以及从血细胞分离的大颗粒和小颗粒成分进行Western blotting的结果表明，α和β亚基均定位于细胞内大颗粒Ta中。此外，在大颗粒成分中发现了与β亚基不同的27kDa蛋白质的存在，该蛋白质与抗β亚基抗体反应。纯化该蛋白质后，进行cDNA克隆，并确定了其结构，脯氨酸顺式。结果表明，它是具有反式异构酶（PPIase）活性的亲环蛋白B同系物。另一方面，当使用通过硫酸葡聚糖-琼脂糖CL-6B粗分级血细胞提取物而获得的级分进行类似分析时，发现含有G因子的0.25M Nacl洗脱级分含有亚基α和β。两者的存在都得到了证实。在流出部分中也检测到了亚基 α。在该级分中未检测到亚基 β，这表明亚基 α 可能单独存在或与其他蛋白质结合存在。