遺伝生化学的手法による転写因子NF-κBの活性制御因子の網羅的スクリーニング

利用遗传生化方法全面筛选转录因子NF-κB活性调节因子

基本信息

批准号：
17657046
负责人：
牟田達史
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Tohoku University (2006)Kyushu University (2005)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、NF-κB活性化因子の網羅的スクリーニングを目的として、まず、NF-κB応答性のE-selectin遺伝子のプロモーターの制御下に、それぞれネオマイシン耐性遺伝子、Green fluorescence protein(GFP)遺伝子、CD14遺伝子を発現するレポータープラスミド3種を構築した。構築したプラスミドを、ブラストサイジン抵抗性遺伝子とともに、interleukin(IL)-3依存性の浮遊細胞であるBa/F3に導入し、ブラストサイジン存在下で数週間培養することにより、stable transformantを十数種類樹立した。また、NF-κB活性化を惹起するレトロウイルスの陽性コントロールとして、Toll-like receptor及びIL-1 receptorの下流で機能するアダプター分子MyD88のN末端側、さらに陰性コントロールとして同分子のC末端側のcDNAを、pMY-IRES-GFPレトロウイルスベクターに導入した。本年度は、これらのレトロウイルスベクターをPlatE細胞に遺伝子導入後、それぞれの遺伝子を発現するレトロウイルスを含む培養上清を回収した。これらの培養上清をそれぞれ、先に樹立したネオマイシン耐性のレポーター遺伝子を導入したBa/F3細胞由来stable transformantに感染させ、ネオマイシン存在下で培養し、レポーター遺伝子発現株の選択を試みた。その結果、一つの株で、MyD88のN末端側を発現するレトロウイルス感染時に特異的な生存が観察された。従って本法は、NF-κB活性化因子の網羅的スクリーニング法として有効であることが示唆された。今後の課題として、スクリーニング効率の上昇を目指した、レポーター遺伝子自身や、スクリーニングに用いる細胞株の更なる改良が望まれる。

在这项研究中，为了全面筛选NF-κB激活剂，首先在NF-κB反应性E-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-纤维蛋白基因的启动子的控制下首先构建了表达新霉素抗性基因，绿色荧光蛋白（GFP）基因和CD14基因的三个报告基因质粒。将构造的质粒与Blastcidin耐药基因一起引入BA/F3，该基因是白介素（IL）-3依赖性的浮池，并在存在Blastcidin存在的情况下培养了几周，从而建立了多种类型的稳定转化剂。此外，作为诱导NF-κB激活的逆转录病毒的阳性对照，在衔接子分子MyD88的N末端侧的cDNA，该cDNA在托架受体的下游功能和类似IL-1受体的功能，以及在Molecules的C-ensinus侧作为阴性对照组的C-末端，引入了PMY-ses-s-s-s-Gfp。在今年，将这些逆转录病毒载体转染到板细胞中后，收集了含有表达每个基因的逆转录病毒的培养上清液。这些培养的上清液中的每一个都被源自BA/F3细胞衍生的稳定转化剂感染，从中引入了先前建立的抗新霉素的记者基因，并在新霉素的存在下进行培养，并试图选择一个表达菌株的报告基因。结果，在表达MyD88的N末端的逆转录病毒感染后，在一种菌株中观察到了特异性生存。因此，已经建议该方法有效作为NF-κB激活剂的详尽筛选方法。作为未来的挑战，希望进一步改善报告基因本身和用于筛查的细胞系，以提高筛选效率。