遺伝生化学的手法による転写因子NF-κBの活性制御因子の網羅的スクリーニング

利用遗传生化方法全面筛选转录因子NF-κB活性调节因子

基本信息

批准号：
17657046
负责人：
牟田達史
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Tohoku University (2006)Kyushu University (2005)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、NF-κB活性化因子の網羅的スクリーニングを目的として、まず、NF-κB応答性のE-selectin遺伝子のプロモーターの制御下に、それぞれネオマイシン耐性遺伝子、Green fluorescence protein(GFP)遺伝子、CD14遺伝子を発現するレポータープラスミド3種を構築した。構築したプラスミドを、ブラストサイジン抵抗性遺伝子とともに、interleukin(IL)-3依存性の浮遊細胞であるBa/F3に導入し、ブラストサイジン存在下で数週間培養することにより、stable transformantを十数種類樹立した。また、NF-κB活性化を惹起するレトロウイルスの陽性コントロールとして、Toll-like receptor及びIL-1 receptorの下流で機能するアダプター分子MyD88のN末端側、さらに陰性コントロールとして同分子のC末端側のcDNAを、pMY-IRES-GFPレトロウイルスベクターに導入した。本年度は、これらのレトロウイルスベクターをPlatE細胞に遺伝子導入後、それぞれの遺伝子を発現するレトロウイルスを含む培養上清を回収した。これらの培養上清をそれぞれ、先に樹立したネオマイシン耐性のレポーター遺伝子を導入したBa/F3細胞由来stable transformantに感染させ、ネオマイシン存在下で培養し、レポーター遺伝子発現株の選択を試みた。その結果、一つの株で、MyD88のN末端側を発現するレトロウイルス感染時に特異的な生存が観察された。従って本法は、NF-κB活性化因子の網羅的スクリーニング法として有効であることが示唆された。今後の課題として、スクリーニング効率の上昇を目指した、レポーター遺伝子自身や、スクリーニングに用いる細胞株の更なる改良が望まれる。

本研究以全面筛选NF-κB激活剂为目的，首先研究了新霉素抗性基因、绿色荧光蛋白（GFP）基因，并构建了表达CD14基因的三种报告质粒。通过将构建的质粒与杀稻瘟素抗性基因一起导入白细胞介素(IL)-3依赖性悬浮细胞Ba/F3，并在杀稻瘟素存在下培养数周，可以完全产生几个物种的稳定转化体。已确立的。此外，作为诱导 NF-κB 激活的逆转录病毒的阳性对照，我们使用了接头分子 MyD88 的 N 端侧，该分子在 Toll 样受体和 IL-1 受体的下游发挥作用，作为阴性对照，我们使用同一分子的C端侧将cDNA引入pMY-IRES-GFP逆转录病毒载体。今年，将这些逆转录病毒载体转染至 PlatE 细胞后，我们收集了含有表达每种基因的逆转录病毒的培养物上清液。使用这些培养上清液来感染源自已导入先前建立的新霉素抗性报告基因的Ba/F3细胞的稳定转化体，并在新霉素存在下培养以尝试选择表达报告基因的菌株。结果，在感染表达 MyD88 N 末端的逆转录病毒后，在一种菌株中观察到了特异性存活。因此，该方法被认为作为 NF-κB 激活剂的综合筛选方法是有效的。未来的工作需要进一步完善报告基因本身以及用于筛选的细胞系，以提高筛选效率。