超精密分子認識を目的とする新世代抗体の創製

创造用于超精确分子识别的新一代抗体

基本信息

批准号：
10145202
负责人：
後藤順一
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

低分子生理活性分子に対する抗ハブテン抗体は、抗体調製時の感作抗原がキャリアープロテインとの複合体であるため、親和定数(Ka)の最大値が10^<12>M^<-1>と低く、分子認識能に乏しい。そこで、まずモノクローナル「抗メタタイプ抗体」及び「抗イディオタイプ抗体」を作製するとともに、遺伝子レベルで抗体分子の相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列をランダムに変換し、生体のレパートリーにはみられない一次構造を有する「人工抗体(超抗体)」のライブラリーを構築し、これによりハプテン抗原に対してきわめて高い特異性と親和力を持つ超抗体の作製を試みた。抗メタタイプ及び抗イディオタイプ抗体の創製抗イディオタイプ抗体と抗メタタイプ抗体を同時に調製するために、そのパラトープをハプテンでアフィニティーラベルした第一抗体で免疫するのが効果的である。そこで、先に調製したモノクローナル抗ウルソデオキシコール酸7-N-アセチルグルコサミニド(UDCA7-NAG)抗体にUDCA7-NAG N-succinimidyl esterを反応させたのちヘモシアニンとの結合体としてA/Jマウスに反復投与した。その脾細胞をP3/NS1/1-Ag4-1ミエローマ細胞と融合し、HAT選択培養を経て6種の抗イディオタイプ抗体産生株を樹立した。その結果、2種(Ab2一44、Ab2-45)は第一抗体のパラトープを認識するβタイプ抗イディオタイプ抗体であり、他の4種は、フレームワーク領域を認識するαタイプ抗体と推定された。そこで、αタイプ抗体Ab2-19とβタイプ抗体Ab2-45を組み合わせて、標識ストレプトアビジンを用いる非競合型idiometric assayを試みたところ、高感度な用量作用曲線(検出限界:500fg)を得ることができた。超抗体の創製モノクローナル抗11-デオキシコルチゾール(S)抗体産生株から全RNAを分離し、RT-PCR法によりV_H及びV_LドメインのDNAを増幅した。両者をPCRスプライシングにより連結すると同時にリンカー配列(Gly_4Ser)_3を導入しscF_V遺伝子(5'V_H-linker-V_L3')を構築した。これをファージディスプレイベクター(pEXmide5)に挿入したのち大腸菌XL1-Blue株に導入し、ヘルパーファージを感染させてファージ抗体を調製した。次いでこのクローン化したscF_V遺伝子をPCRにより増幅するとともに、その3'末端にHis6 tag及びオーカーコドンを付加した。これをpEXmide5ベクターに挿入し、大腸菌XL1-Blue株に発現させて、可溶型scF_Vをペリプラズム抽出物として得た。本scF_Vの親和力、特異性をトリチウム標識Sを用いるRIAにより検討したところ、対応する天然型モノクローナル抗S抗体(MAb)の性質を十分に保持しており、しかも親和定数が1.3x10^<10>M^<-1>と極めて高いことが判明した。

对小生物活性分子的抗丁烯抗体具有低分子量抗体复合物与载体蛋白的抗体，因此最大亲和力常数（Ka）为10^<12> m^<-1>，并且分子识别能力较差。 Therefore, we first produced monoclonal "antimetatype antibodies" and "antiidiotype antibodies," and randomly converted the amino acid sequence of the complementarity determining region (CDR) of the antibody molecule at the gene level, and constructed a library of "artificial antibodies (super antibodies)" with primary structures not found in the repertoire of a living organism, and attempted to create具有极高特异性和对抗原抗原的亲和力的超抗体。创建抗中型和抗IDO典型抗体，以同时制备抗IDiotype和抗甲状腺典型的抗体，具有首次用触觉标记的抗体亲和力对角膜蛋白酶进行免疫性。因此，先前制备的单克隆抗脱氧甲酸氯酸酯7-N-乙酰葡萄糖胺（UDCA7-NAG）抗体与UDCA7-NAG N-核酸N-核苷酸酯反应，然后重复给A/J小鼠作为与血氧烷的结合物。将脾细胞与P3/NS1/1-AG4-1骨髓瘤细胞融合在一起，在选择性HAT培养后，建立了六种抗IDiotype抗体产生菌株。结果，两种物种（AB2144，AB2-45）是识别第一抗体的副型的β型抗IDioty型抗体，而其他四个物种是识别框架区域的α型抗体。因此，尝试使用α型抗体AB2-19和β型抗体AB2-45（一种高度敏感的剂量效果曲线（检测极限：500fg）），尝试使用使用标记链霉亲和素的非竞争特分测定法。从单克隆抗-11-脱氧核糖醇（S）抗体产生菌株中分离出产生超抗体总RNA，并通过RT-PCR扩增V_H和V_L结构域中的V_H和V_L结构域中的DNA。两者通过PCR剪接链接，同时引入了链接序列（GLY_4SER）_3来构建SCF_V基因（5'V_H-Linker-V_L3'）。将其插入噬菌体显示载体（PEXMIDE5），然后引入大肠杆菌XL1-Blue菌株中，并用辅助噬菌体感染以制备噬菌体抗体。然后通过PCR扩增克隆的SCF_V基因，并将His6标签和Ocher密码子添加到3'端。将其插入PEXmide5载体中，并在大肠杆菌XL1-蓝色菌株中表达，以获得可溶性SCF_V作为周质提取物。使用标有S的Tritium RIA研究了该SCF_V的亲和力和特异性，发现它充分保留了相应的天然单克隆抗S抗体（MAB）的特性，其亲和力常数在1.3x10^<10> m^<-1>> 1.3x10^<10> m^<-1>>中极高。