超精密分子認識を目的とする新世代抗体の創製

创造用于超精确分子识别的新一代抗体

基本信息

批准号：
10145202
负责人：
後藤順一
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

低分子生理活性分子に対する抗ハブテン抗体は、抗体調製時の感作抗原がキャリアープロテインとの複合体であるため、親和定数(Ka)の最大値が10^<12>M^<-1>と低く、分子認識能に乏しい。そこで、まずモノクローナル「抗メタタイプ抗体」及び「抗イディオタイプ抗体」を作製するとともに、遺伝子レベルで抗体分子の相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列をランダムに変換し、生体のレパートリーにはみられない一次構造を有する「人工抗体(超抗体)」のライブラリーを構築し、これによりハプテン抗原に対してきわめて高い特異性と親和力を持つ超抗体の作製を試みた。抗メタタイプ及び抗イディオタイプ抗体の創製抗イディオタイプ抗体と抗メタタイプ抗体を同時に調製するために、そのパラトープをハプテンでアフィニティーラベルした第一抗体で免疫するのが効果的である。そこで、先に調製したモノクローナル抗ウルソデオキシコール酸7-N-アセチルグルコサミニド(UDCA7-NAG)抗体にUDCA7-NAG N-succinimidyl esterを反応させたのちヘモシアニンとの結合体としてA/Jマウスに反復投与した。その脾細胞をP3/NS1/1-Ag4-1ミエローマ細胞と融合し、HAT選択培養を経て6種の抗イディオタイプ抗体産生株を樹立した。その結果、2種(Ab2一44、Ab2-45)は第一抗体のパラトープを認識するβタイプ抗イディオタイプ抗体であり、他の4種は、フレームワーク領域を認識するαタイプ抗体と推定された。そこで、αタイプ抗体Ab2-19とβタイプ抗体Ab2-45を組み合わせて、標識ストレプトアビジンを用いる非競合型idiometric assayを試みたところ、高感度な用量作用曲線(検出限界:500fg)を得ることができた。超抗体の創製モノクローナル抗11-デオキシコルチゾール(S)抗体産生株から全RNAを分離し、RT-PCR法によりV_H及びV_LドメインのDNAを増幅した。両者をPCRスプライシングにより連結すると同時にリンカー配列(Gly_4Ser)_3を導入しscF_V遺伝子(5'V_H-linker-V_L3')を構築した。これをファージディスプレイベクター(pEXmide5)に挿入したのち大腸菌XL1-Blue株に導入し、ヘルパーファージを感染させてファージ抗体を調製した。次いでこのクローン化したscF_V遺伝子をPCRにより増幅するとともに、その3'末端にHis6 tag及びオーカーコドンを付加した。これをpEXmide5ベクターに挿入し、大腸菌XL1-Blue株に発現させて、可溶型scF_Vをペリプラズム抽出物として得た。本scF_Vの親和力、特異性をトリチウム標識Sを用いるRIAにより検討したところ、対応する天然型モノクローナル抗S抗体(MAb)の性質を十分に保持しており、しかも親和定数が1.3x10^<10>M^<-1>と極めて高いことが判明した。

抗脉珠抗体抗体分子分子的抗体为10^<12> m^<-1>，因为制备抗体时的敏感抗原是载体蛋白质的复合物。因此，首先，创建了单克隆“抗蛋白酶型抗体”和“抗抗体抗体”，在遗传水平上，抗体分子分子（CDR）的氨基酸序列被转化为随机，并且在遗传水平上，它在随机中，在生命的身体曲目。 Antometa类型和抗替代型抗体同时可以有效制备抗体和抗体类型抗体，并且具有首次用Haptene标记的首次抗体亲和力的角膜蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白抗体有效。因此，在将UDCA7-NAG N-核苷酸酯与早期制备的抗体反应后，UDCA7-NAG N-核苷酯对二酰二酰酯反应，该酯反应于较早的重复给药。将脾细胞与P3/NS1/1-AG4-1 Mieloma细胞融合，并通过HAT选择培养物建立了六种抗二氧化碳抗体生产量。结果，两种类型（AB2 1 44，AB2-45）是β型抗Dio-Dio-type抗体，它们识别第一抗体的角膜蛋白酶，而其他四种估计是α型抗体，它识别识别的α型抗体框架区域。因此，当α型抗体AB2-19和β型抗体AB2-45的组合时，在尝试使用非竞争力的鉴定分析时，获得了高敏剂剂量ACT曲线（检测极限：500FG）我能够做到。将所有RNA与体内产生的单克隆抗体11-脱氧菌（S）抗体生产菌株分离，并将RT-PCR方法放大了V_H和V_L域DNA。同时，构建了链接序列（GLY_4SER）_3与PCR弹簧同时引入，并构建了SCF_V基因（5'V_H-Linker-V_L3'）。将其插入噬菌体显示器（PEXMIDE5）中，并将其引入大肠杆菌XL1-Blue菌株中，并感染了助手Fajge以制备噬菌体抗体。然后，通过PCR扩增了这个克隆的SCF_V基因，并将His6标签和Orcodon添加到3'端的末端。将其插入pexmide5载体中，该载体在大肠杆菌XL1蓝色菌株中表达，并获得可溶性SCF_V作为腹膜提取物。当使用tritium符号s检查RIA的亲和力和特异性时，它充分维持了相应的天然单克隆抗体（MAB）的性质，并且亲和力为1.3x10^<0>。 M^<-1>非常高。