新世代抗体を活用する内分泌撹乱物質のハイスループットスクリーニングシステム

使用新一代抗体的内分泌干扰物高通量筛选系统

基本信息

批准号：
14042204
负责人：
後藤順一
金额：
$ 2.69万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

環境中女性ホルモン様物質の影響を精査するために、エストラジオール(E_2)のハイスループットスクリーニング法が切望され、高親和力で特異的な抗体が求められている。野生型抗体の相補性決定部(CDR)にランダム変異を導入することにより高性能な改変抗体の創製が可能と期待される。そこで、error-prone PCRにより得られる変異CDR遺伝子断片を野生型抗体のフレームワーク(FR)遺伝子にランダムに組み込む"CDRシャッフリング"に基づく変異抗E_2抗体の創製を企てた。先に樹立した抗E_2抗体産生ハイブリドーマ株よりRNAを単離し、RT-PCRによりH鎖及びL鎖可変部(V_H,V_L)遺伝子をクローニングした。これらを連結して一本鎖Fvフラグメント(scFv)の遺伝子を構築し、その産物である野生型scFvを用いて競合ELISAを行った結果、遊離E_2添加量2-200ngにおいて用量作用曲線が得られた。本scFv遺伝子を鋳型として0.5又は1.0mM MnCl_2存在下でerror-prone PCRを行い、変異クローン27種のV_H及びV_L塩基配列を解析したところ、最大13%の高い効率で点変異の導入が認められた。その一方で、V_H、V_L各ドメインに対応する遺伝子の全長をそれぞれ6本の一本鎖合成オリゴDNA(5'側から#1〜#6;およそ60〜120merの範囲)に分解し,これをrecursive PCRに付すことで元のscFv遺伝子が再構成されることを確認した。得られた変異scFv遺伝子群のCDR部分をPCRにより増幅することで、変異CDR遺伝子断片群(#2、3、5に相当)を調製することができる。これらを野生型FR遺伝子断片(#1、#4、#6に相当)と混合してrecursive PCRに付すことで得られるCDRシャッフリングライブラリーから、親和力と特異性に優れる変異抗体の探索が可能と期待される。

为了仔细检查女性激素在环境中的影响，需要高坡度（E_2）高 - 美型筛查方法，并且需要具有高中的特定抗体。可以预期，可以通过将随机突变引入野生型抗体的互补测定单元（CDR）来创建高性能修饰的抗体。因此，我们试图基于“ CDR改组”创建可变的E_2抗体，该抗体随机地融入了由易用错误的PCR获得的变体CDR基因片段中，将其纳入野生型抗体框架（FR）基因中。将RNA与已建立的抗E_2抗体生产杂交瘤库存分离，RT-PCR克隆了H链和L链可变部分（V_H，V_L）基因。单链FV片段（SCFV）的基因被合并，并且由于使用野生型SCFV竞争ELISA（即产品），因此可以使用免费的E_2额外2-200 ng获得剂量曲线。易于发行的PCR以0.5或1.0mm的MNCL_2作为模具进行，分析27个变量克隆V_H和V_L基本序列，已允许以最大13％的高效率引入它。另一方面，将与每个域的每个结构域相对应的基因的总长度分为六个单链合成寡核心DNA（从5'侧到＃1到＃6；大约60到120mer）原始的SCFV基因是通过连接递归PCR重建的。通过通过PCR扩增获得的突变体SCFV基因组的CDR部分，可以制备可变的CDR基因片段化基团（相当于＃2、3、5）。从与野生FR基因片段（相当于＃1，＃4，＃6）混合的CDR库中，并附着在递归PCR上，可以搜索具有良好亲和力和特异性的突变抗体。