超精密分子認識を目的とする新世代抗体の創製

创造用于超精确分子识别的新一代抗体

基本信息

批准号：
11132201
负责人：
後藤順一
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

低分子量生理活性物質(ハプテン)に対する抗体の親和定数(Ka)は最大10^<12>M^<-1>程度と低く、しかも必ずしも十分な分子認識能を示さない。この問題を克服するために、従来調製が困難とされているモノクローナル抗メタタイプ抗体及び抗イディオタイプ抗体(抗ハプテン抗体の可変部を、抗原の存在下又は非存在下に特異的に認識する第二抗体)を免疫化学及び細胞生化学的技術を駆使して作製することを試みた。さらに、遺伝子レベルで抗体分子の相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列をランダムに変換して人工抗体(超抗体)ライブラリーの構築を試みた。抗メタタイプ及び抗イディオタイプ抗体の創製既にウルソデオキシコール酸 7-N-アセチルグルコサミニド(UDCA 7-NAG)に対するモノクローナル抗体可変部のフレームワーク及びパラトープを認識するαタイプ、βタイプのモノクローナル抗イディオタイプ抗体の樹立に成功した。そこで、これらを組み合わせて非競合型イムノアッセイを試みた。本アッセイ系で用量作用曲線を作成したところ、優れた感度(検出限界70fg = 118amol)が得られた。また臨床応用上有利な特異性を示し、ヒト尿試料中のUDCA 7-NAG 及びそのグリシン、タウリン抱合体を群特異的に測定することが可能であった。本アッセイは、とくに原発性胆汁性肝硬変症の診断に有用と期待される。なお、11-デオキシコルチゾール(11-DC)についても同様に抗イディオタイプ抗体を樹立し、好感度な非競合型アッセイを確立した。超抗体の創製 11-DC抗体産生株から増幅したV_H及びV_LドメインのDNAを連結して一本鎖Fvフラグメント(scFv)遺伝子を構築し、可溶型scFvを調整したところ、11-DCに極めて高い親和力(Ka 1.3x 10^<10>M^<-1>)を示した。また、各種の近縁ステロイドや抗イディオタイプ抗体との反応性から、本scFvはオリジナル抗体と類似のパラトープ構造を有し、その性質を十分に保持していることが示された。本フラグメントを出発物質としてミュータント抗体ライブラリーを構築し、天然型抗体を上回る親和力、特異性を有する新規抗体分子種の探索が可能と期待される。

抗体对低分子量生理活性物质(半抗原)的亲和常数(Ka)最多低至10^12M^-1，并且它们不一定表现出足够的分子识别能力。为了解决这个问题，我们开发了单克隆抗元型抗体和抗独特型抗体（在存在或不存在抗原的情况下特异性识别抗半抗原抗体的可变区的抗半抗原抗体，这是很难制备的）。尝试使用免疫化学和细胞生化技术生产两种抗体。此外，我们尝试通过在基因水平上随机转换抗体分子的互补决定区（CDR）的氨基酸序列来构建人工抗体（超级抗体）文库。抗元型和抗独特型抗体的创建针对熊去氧胆酸 7-N-乙酰氨基葡萄糖苷 (UDCA 7-NAG) 的单克隆抗体，识别可变区的框架和互补位的 α 型和 β 型单克隆抗体已经开发出来。我们成功建立了独特型抗体。因此，我们尝试将这些结合起来进行非竞争性免疫测定。当使用该测定系统创建剂量反应曲线时，获得了出色的灵敏度（检测限 70 fg = 118 amol）。它还表现出有利于临床应用的特异性，并且能够对人尿液样本中的 UDCA 7-NAG 及其甘氨酸和牛磺酸缀合物进行分组特异性测量。该测定预计在原发性胆汁性肝硬化的诊断中特别有用。此外，我们同样建立了针对 11-脱氧皮质醇 (11-DC) 的抗独特型抗体，并建立了灵敏的非竞争性测定。超级抗体的创建通过连接从11-DC抗体产生菌株扩增的V_H和V_L结构域DNA构建单链Fv片段（scFv）基因，并制备可溶性scFv，其显示出高亲和力（Ka 1.3x 10^）。 <10>M^<-1>)。此外，与各种密切相关的类固醇和抗独特型抗体的反应性表明，该scFv具有与原始抗体相似的互补位结构，并充分保留了其特性。预计通过使用该片段作为起始材料构建突变抗体文库，将有可能寻找比天然抗体具有更高亲和力和特异性的新抗体分子种类。