超精密分子認識を目的とする新世代抗体の創製

创造用于超精确分子识别的新一代抗体

基本信息

批准号：
11132201
负责人：
後藤順一
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

低分子量生理活性物質(ハプテン)に対する抗体の親和定数(Ka)は最大10^<12>M^<-1>程度と低く、しかも必ずしも十分な分子認識能を示さない。この問題を克服するために、従来調製が困難とされているモノクローナル抗メタタイプ抗体及び抗イディオタイプ抗体(抗ハプテン抗体の可変部を、抗原の存在下又は非存在下に特異的に認識する第二抗体)を免疫化学及び細胞生化学的技術を駆使して作製することを試みた。さらに、遺伝子レベルで抗体分子の相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列をランダムに変換して人工抗体(超抗体)ライブラリーの構築を試みた。抗メタタイプ及び抗イディオタイプ抗体の創製既にウルソデオキシコール酸 7-N-アセチルグルコサミニド(UDCA 7-NAG)に対するモノクローナル抗体可変部のフレームワーク及びパラトープを認識するαタイプ、βタイプのモノクローナル抗イディオタイプ抗体の樹立に成功した。そこで、これらを組み合わせて非競合型イムノアッセイを試みた。本アッセイ系で用量作用曲線を作成したところ、優れた感度(検出限界70fg = 118amol)が得られた。また臨床応用上有利な特異性を示し、ヒト尿試料中のUDCA 7-NAG 及びそのグリシン、タウリン抱合体を群特異的に測定することが可能であった。本アッセイは、とくに原発性胆汁性肝硬変症の診断に有用と期待される。なお、11-デオキシコルチゾール(11-DC)についても同様に抗イディオタイプ抗体を樹立し、好感度な非競合型アッセイを確立した。超抗体の創製 11-DC抗体産生株から増幅したV_H及びV_LドメインのDNAを連結して一本鎖Fvフラグメント(scFv)遺伝子を構築し、可溶型scFvを調整したところ、11-DCに極めて高い親和力(Ka 1.3x 10^<10>M^<-1>)を示した。また、各種の近縁ステロイドや抗イディオタイプ抗体との反応性から、本scFvはオリジナル抗体と類似のパラトープ構造を有し、その性質を十分に保持していることが示された。本フラグメントを出発物質としてミュータント抗体ライブラリーを構築し、天然型抗体を上回る親和力、特異性を有する新規抗体分子種の探索が可能と期待される。

低分子量生理活性物质（HAPTENE）的抗体的亲和力常数（Ka）在最大10^<12> m^<-1>的情况下低，并且不一定表现出足够的分子识别能力。为了克服这个问题，我们试图制造单克隆抗中型抗体和抗IDiotype抗体（第二抗体在存在或不存在抗原的情况下明确识别抗Haptene抗体的可变部分，以前被认为是难以使用免疫化学和细胞生物学生物学技术制备的，这些抗体在存在或不存在抗原的情况下。此外，我们试图通过随机转化基因水平抗体分子的互补性确定区域（CDR）的氨基酸序列来构建人工抗体（超级抗体）文库。 Creation of anti-metatype and anti-idiotype antibodies We have already succeeded in establishing monoclonal anti-idiotype antibodies of the α-type and β-type that recognize the framework and paratope of monoclonal antibody variable region against ursodeoxycholic acid 7-N-acetylglucosaminide (UDCA 7-NAG).因此，将这些合并以尝试非竞争性免疫测定。在此测定系统中制备了剂量作用曲线和出色的灵敏度（检测极限为70fg = 118amol）。它还显示出对临床应用的优势特异性，并且可以特异性地测量人类尿液样品中的UDCA 7-NAG及其甘氨酸和牛磺酸偶联物。预计该测定在诊断原发性胆道肝硬化方面特别有用。此外，还为11-脱氧质醇（11-DC）建立了抗IDiotype抗体，并建立了有利的非竞争测定法。当从11-DC抗体生产菌株中扩增的V_H和V_L结构域的DNA与构造单链FV片段（SCFV）基因相关联，并调整了可溶性SCFV，它显示出极高的亲和力（ka 1.3x 10^10^<10> m^<-1>），创建超级抗体。此外，具有各种密切相关类固醇和抗IDiotype抗体的反应性表明，该SCFV具有与原始抗体相似的寄生虫结构，并且其特性完全保留。可以预期，可以使用该片段作为起始材料来构建突变抗体库，并且可以搜索具有亲密和特异性的新抗体分子物种。