創薬を目指すファーマコプロテオミクスの基盤研究

药物发现的药物蛋白质组学基础研究

基本信息

批准号：
13877379
负责人：
後藤順一
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13877379/
关键词：
プロテオミクスファーマコプロテオミクスゲノム創薬質量分析法ペルオキシレドキシンアシルアデニレートイムノアフィニティー抽出アフィニティーラベル化胆汁酸デオキシコール酸ディファレンシャルディスプレー

项目摘要

本格的なポストゲノム時代が到来し、世界の各製薬企業はゲノム情報を活用する新規医薬品開発の方向性を模索している。こうした中、薬物や生理活性物質刺激が誘起する変化を分子レベルで捕らえ、標的蛋白質の機能を解析することにより、新たな創薬標的分子を探索するファーマコプロテオミクス手法の確立に多大な期待が寄せられている。本年度は、リン酸による翻訳後修飾蛋白質解析法を検討するとともに、アフィニティーラベル化法とイムノアフィニティー抽出法を駆使した低分子-蛋白質相互作用解析法の構築を試みた。前年度の結果から、デオキシコール酸刺激によるペルオキシレドキシンIの変動には、リン酸による翻訳後修飾が関与している可能性が示唆された。そこで、2次元ゲル電気泳動マップのディファレンシャルディスプレイを用いるリン酸化蛋白質特定法につき検討した。試料をあらかじめアルカリホスファターゼにより脱リン酸化反応に付した後、2次元ゲル電気泳動法により蛋白質を分離し、マップ化した。次いで、脱リン酸化処理を行わない試料と比較したところ、容易にリン酸化蛋白質を特定できることが判明した。しかも、分離した蛋白質スポットをゲル内にてアルカリホスファターゼ反応に付した後、負イオン検出MALDI-TOFMSにて測定することにより、リン酸化ペプチドを高感度に検出できることが判明した。加えてエキソペプチダーゼを用いるペプチドラダーシークエンス法を用いることにより、そのリン酸化部位の特定も可能であることが明らかとなった。一方、低分子-蛋白質相互作用解析を目的としてアシルアデニレートをアフィニティーラベル化剤として用い、その有用性を吟味したところ、相互作用部位に選択的なラペル化が可能であることが判明した。しかもイムノアフィニティー抽出法を駆使して酵素消化により得たラベル化ペプチドを選択的に抽出し、ラベル化部位の構造解析も可能であることを実証した。

完整的 - 基因组时代已经到来，世界上的制药公司正在寻找利用基因组信息的新药开发方向。在这种情况下，建立PACO蛋白质组学方法的期望很高，可以通过捕获在分子水平上诱导药物以及生理和活性材料刺激的变化并分析靶蛋白的功能正在。在这个财政年度，我们检查了通过磷酸翻译后的修饰蛋白分析方法，并试图构建一种使用亲和力标记定律和imno-hiention萃取方法的低分子蛋白 - 蛋白质相互作用分析方法。上一年的结果表明，由于磷酸翻译后，由于右氧氨酸刺激而引起的皮多氧蛋白I的波动可能参与翻译。因此，我们使用两维凝胶电泳图的差异显示了磷酸化的蛋白质规范方法。将样品应用于碱性霍斯法蛋白酶对右旋反应后，将蛋白质分离，并通过两维凝胶电泳方法分离蛋白质。然后，与未执行氧化氧化的样品相比，事实证明，磷酸化的蛋白很容易被鉴定出来。此外，已经发现，可以通过将分离的蛋白质斑点应用于凝胶中的碱性霍斯法蛋白酶反应，然后用负离子检测MALDI-TOFMS测量，从而在高灵敏度下检测到肽磷酸化。此外，很明显，使用磷酸化酶使用肽序列方法的使用可以通过磷酸化位点鉴定。另一方面，发现有用性用作分析低分子 - 蛋白质相互作用的亲和力标记剂，并且发现可以将选择性翻领选择到相互作用位点。此外，他证明，使用IMNoopinity提取方法选择性提取了通过酶消化获得的标记肽，并且可以对标记位点的结构分析进行结构分析。