内分泌攪乱物質のスクリーニングを目的とする新世代抗体の創製

创建新一代抗体来筛选内分泌干扰物

基本信息

批准号：
13027207
负责人：
後藤順一
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

河川及び下水中の女性ホルモン様物質による生物への影響を精査するために、エストラジオール(E_2)の簡便で信頼度の高いスクリーニング法が切望されている。ELISA法は、操作が簡単で検体処理能力が大きいため、新しい日常分析法として応用が試みられている。しかし、従来の抗体は必ずしも十分な特異性を示さない。E_2のようなハプテンに対する特異抗体を得るためには、その分子構造を特徴づける官能基から離れた部位にキャリアタンパクを結合させた免疫原を用いることが重要である。そこで、ステロイド核B環上にキャリア結合部位を有するハプテン誘導体を用いてマウスを免疫し、抗E_2特異モノクローナル抗体の調製を試みた。7-carboxyethylthio-estradiol(7-CEr)をウシ血清アルブミンと結合させて、ハプテン-キャリア結合体を調製した。本免疫原でBALB/c、A/J、及びC57BL/6マウスを繰り返し免疫し、血清中抗体の性質をペルオキシダーゼ(HRP)標識7-CErを用いるELISAで調べた。最も良好な応答を示したBALB/cマウス個体の脾細胞をNS1ミエローマ細胞と融合させて、2種の抗体産生クローン(#4-4、#17-5;いずれもγ1、κ)を樹立した。これら抗体を用いてE_2に対する用量作用曲線を作製したところ、およそ10〜1000pgの範囲で定量が可能と思われた。また交差反応性はエストロン(0.21%、0.26%)、エストリオ-ル(2.2%、2.6%)、E_2 17-グルクロニド(<0.005%)、E_2 3-サルフェート(<0.05%)で、実用的な特異性を有するものと期待された。

为了研究河流和污水中雌性激素样物质对生物体的影响，迫切需要一种简单可靠的雌二醇（E_2）筛查方法。 ELISA方法操作简便，样品处理量大，因此正在作为一种新的常规分析方法得到应用。然而，常规抗体不一定表现出足够的特异性。为了获得针对 E_2 等半抗原的特异性抗体，重要的是使用具有载体蛋白的免疫原，该载体蛋白附着在远离表征其分子结构的官能团的位点上。因此，我们尝试用在类固醇核的B环上具有载体结合位点的半抗原衍生物免疫小鼠来制备抗E_2特异性单克隆抗体。通过将 7-羧乙硫基雌二醇 (7-CEr) 与牛血清白蛋白缀合来制备半抗原载体缀合物。用该免疫原反复免疫 BALB/c、A/J 和 C57BL/6 小鼠，并使用过氧化物酶 (HRP) 标记的 7-CEr 通过 ELISA 检查血清中抗体的特性。通过融合 BALB/c 小鼠个体的脾细胞，建立了两个产生抗体的克隆（#4-4 和 #17-5；γ1 和 κ），该克隆与 NS1 骨髓瘤细胞表现出最佳反应。当我们使用这些抗体创建 E_2 的剂量反应曲线时，似乎可以在大约 10-1000 pg 的范围内进行定量。此外，交叉反应性为雌酮（0.21%、0.26%）、雌三醇（2.2%、2.6%）、E_2 17-葡萄糖醛酸苷（<0.005%）和E_2 3-硫酸酯（<0.05%），使其实用化预计他会发生性行为。