酵母無細胞タンパク質合成系の改変によるSsaタンパク質のシャペロン機能解析

改造酵母无细胞蛋白合成系统分析Ssa蛋白的伴侣功能

• 批准号: 07780621
• 负责人: 西川 周一
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780621/
• 关键词: 分子シャペロン; hsp70; ミトコンドリア; 膜透過; 無細胞タンパク質合成系

本研究では,酵母無細胞タンパク質合成系を元にしてサイトゾル中のSsaタンパク質の量を制御できる実験系の開発を行なった.まず,Ssa1タンパク質のC末端部分に(His)_6タグを導入した組み替えタンパク質(Ssa1-Hisp)のみをSsaタンパク質として発現している酵母株より,Moldaveらの方法に従って無細胞タンパク質合成用の酵母ライセ-トを調製した.次に,(His)_6タグに対するアフィニティーカラムであるニッケルレジンカラムを用いて,この酵母ライセ-トからSsaタンパク質を除去する条件の検討を行なった.その結果,タンパク質合成能を保持した状態でライセ-ト中のSsaタンパク質の85%を除去することができた.Ssaタンパク質を除去した酵母ライセ-トを用いてミトコンドリアタンパク質前駆体(pCOXIV-DHFR,F1β前駆体)を合成し,単離ミトコンドリアへの輸送実験を行なったところ,これらは共に,Ssaタンパク質除去前のライセ-トを用いて合成した場合と同程度の輸送効率でミトコンドリアに取り込まれた.抗Ssaタンパク質抗体はこれら前駆体の単離ミトコンドリアへの輸送を阻害したので,Ssaタンパク質は前駆体のミトコンドリアへの輸送に必要であることが示唆される.そこでこれはSsaタンパク質の除去が不十分であったためではないかと考えられる.現在,誘導可能なプロモーターであるGAL1プロモーターによるSSA1-His遺伝子の発現制御と組み合わせて,Ssaタンパク質の除去効率の改善を行なっている.Ssaタンパク質の活性はパートナータンパク質であるYdj1pによって制御されている.パートナータンパク質の側からSsaタンパク質の活性制御を行なうため,YDJ1遺伝子破壊株から酵母ライセ-トを調製した.このライセ-トを用いて合成した前駆体タンパク質の性質についても,現在解析を進めている.

在本研究中，我们开发了一个基于酵母无细胞蛋白质合成系统的实验系统，可以控制胞浆中Ssa蛋白的量。首先，我们在Ssa1的C端部分引入了(His)_6标签。根据 Moldave 等人的方法，从仅表达重组蛋白 (Ssa1-Hisp) 作为 Ssa 蛋白的酵母菌株制备用于无细胞蛋白合成的酵母裂解物。标签已准备好。我们研究了使用镍树脂柱从酵母裂解液中去除 Ssa 蛋白的条件。结果，我们发现裂解液中 85% 的 Ssa 蛋白可以被去除，同时保留蛋白质合成能力。当我们使用已去除 Ssa 蛋白的酵母裂解液合成线粒体蛋白前体（pCOXIV-DHFR、F1β 前体）时，我们进行了一项将其转运至分离线粒体的实验。这两种物质都被吸收到线粒体中，其转运效率与在 Ssa 蛋白去除之前使用裂解物合成的转运效率相当。抗 Ssa 蛋白抗体抑制了这些前体转运到分离的线粒体中。因此，表明 Ssa 蛋白是前体转运至线粒体。这可能是由于Ssa蛋白去除不充分所致。目前，诱导型启动子GAL1专业结合电机对SSA1-His基因的表达控制，我们正在提高Ssa蛋白的去除效率。Ssa蛋白的活性由伙伴蛋白Ydj1p控制。Ssa蛋白的活性由为了控制这一点，我们从 YDJ1 基因破坏的菌株中制备了酵母裂解物，我们目前正在分析使用该裂解物合成的前体蛋白的特性。

项目成果

佐藤健: "Membrane protein retrieval from the Golgi apparatus to the endoplasmic reticulum(ER):characterization of the RER1 gene product as a component involved in ER localization of Sec12p" Molecular Biology of the Cell. 6. 1459-1477 (1995)

Ken Sato：“从高尔基体到内质网 (ER) 的膜蛋白回收：RER1 基因产物作为参与 Sec12p ER 定位的成分的表征”《细胞分子生物学》6. 1459-1477 (1995)。