酵素のDNA配列特異性を変換する分子シャペロンの役割

分子伴侣在酶的 DNA 序列特异性转化中的作用

基本信息

批准号：
12780483
负责人：
水村光
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

出芽酵母ミトコンドリアの配列特異的エンドヌクレアーゼEndo. SceIは50Kと75Kサブユニットのヘテロ量体として精製され、のちに前者が触媒サブユニット、後者はミトコンドリア局在型の70-kDa熱ショツク蛋白質(mtHSP70)であることが判明した。50Kは単独で配列特異性の厳密な26塩基認識のDNA切断活性を示すが、mtHSP70との複合体形成で特異性が緩み様々なDNAを切断できるように変化する。50Kの様に分子シャペロンHSP70が安定に結合したまま酵素活性を変換する例は他に報告がなく、この活性変換機構を調べ以下の結果を得た。(1)50Kと同じアミノ酸配列モチーフを持つホーミングエンドヌクレアーゼ単量体は、100種類以上全てで単一DNA配列に特異的な活性を持つ。50Kのみに独特なN末端200アミノ酸を人為的に欠損させると、単一配列特異的ヌクレアーゼ活性は残ったが、mtHSP70との相互作用、及び配列特異性の変換ができなかった。これは、元来、単量体酵素だった50KがN末端に付加的領域を得て、mtHSP70の結合と配列特異性の緩みを獲得した可能性を示している。(2)別の酵母株由来のEndo. SuvIはEndo. SceIの相同酵素で、50Kのアミノ酸配列上2箇所で置換が存在する。相同50K単量体間の活性に差はなく、2アミノ酸の違いはサイレントな置換であった。mtHSP70との複合体形成は両50Kの配列特異性を緩めたが、一部のDNA配列はEndo. SceIにのみ特異的で、Endo. SuvIでは切断できなかった。この結果は本来、違いをもたらさないアミノ酸点変異をmtHSP70が表現型の差として表面化させる事を示している。分子シャペロンmtHSP70は50Kの基質特異性を変換する能力に加え、点変異の表現型変化を生み、酵素の進化を促進する働きがあることを示唆している。

特定于序列的核酸内切酶内核。萌芽的酵母线粒体的SCEI被纯化为50K和75K亚基的异构体，后来被发现是以前的催化亚基，是线粒体定位的70 kDa热摄影剂蛋白（MTHSP70）的后者。仅50K表现出严格的26个基本识别DNA裂解活性，具有序列特异性，但与MTHSP70的络合会导致宽松的特异性和变化以允许分裂各种DNA。没有其他关于分子伴侣HSP70转化酶活性的报道，同时保持稳定的结合（例如50K），并且通过检查该活性转换机制获得了以下结果。（1）具有相同氨基酸序列基序的所有100种或更多类型的归核核酸内切酶单体与50K具有特定于单个DNA序列的活性。仅在50K左序列特异性核酸酶活性的独特200 N末端氨基酸的人工缺失，但未能与MTHSP70相互作用并转换序列特异性。这表明最初是一种单体酶的50K可能在N末端获得了另一个区域，从而达到了MTHSP70结合和松散的序列特异性。（2）endo。来自另一种酵母菌菌株的SUVI是一种同源的endo酶。 SCEI，在50K的氨基酸序列上的两个位置取代。同源50k单体之间的活性没有差异，两个氨基酸之间的差异是无声的替代。与MTHSP70的络合使两种50K的序列特异性松动，但某些DNA序列仅针对内托。 SCEI，无法与Endo分裂。 suvi。该结果表明，MTHSP70表面氨基酸点突变，这些突变本质上不会导致表型差异。除了在50K处转换底物特异性的能力外，分子伴侣MTHSP70还会在点突变中产生表型变化，并表明它有助于促进酶的演化。