酵素のDNA配列特異性を変換する分子シャペロンの役割

分子伴侣在酶的 DNA 序列特异性转化中的作用

基本信息

批准号：
12780483
负责人：
水村光
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

出芽酵母ミトコンドリアの配列特異的エンドヌクレアーゼEndo. SceIは50Kと75Kサブユニットのヘテロ量体として精製され、のちに前者が触媒サブユニット、後者はミトコンドリア局在型の70-kDa熱ショツク蛋白質(mtHSP70)であることが判明した。50Kは単独で配列特異性の厳密な26塩基認識のDNA切断活性を示すが、mtHSP70との複合体形成で特異性が緩み様々なDNAを切断できるように変化する。50Kの様に分子シャペロンHSP70が安定に結合したまま酵素活性を変換する例は他に報告がなく、この活性変換機構を調べ以下の結果を得た。(1)50Kと同じアミノ酸配列モチーフを持つホーミングエンドヌクレアーゼ単量体は、100種類以上全てで単一DNA配列に特異的な活性を持つ。50Kのみに独特なN末端200アミノ酸を人為的に欠損させると、単一配列特異的ヌクレアーゼ活性は残ったが、mtHSP70との相互作用、及び配列特異性の変換ができなかった。これは、元来、単量体酵素だった50KがN末端に付加的領域を得て、mtHSP70の結合と配列特異性の緩みを獲得した可能性を示している。(2)別の酵母株由来のEndo. SuvIはEndo. SceIの相同酵素で、50Kのアミノ酸配列上2箇所で置換が存在する。相同50K単量体間の活性に差はなく、2アミノ酸の違いはサイレントな置換であった。mtHSP70との複合体形成は両50Kの配列特異性を緩めたが、一部のDNA配列はEndo. SceIにのみ特異的で、Endo. SuvIでは切断できなかった。この結果は本来、違いをもたらさないアミノ酸点変異をmtHSP70が表現型の差として表面化させる事を示している。分子シャペロンmtHSP70は50Kの基質特異性を変換する能力に加え、点変異の表現型変化を生み、酵素の進化を促進する働きがあることを示唆している。

酿酒酵母线粒体序列特异性核酸内切酶 SceI 被纯化为 50K 和 75K 亚基的异聚体，前者是催化亚基，后者是线粒体定位的 70 kDa 热休克蛋白 (mtHSP70)。。 50K单独表现出具有严格序列特异性的DNA切割活性，可识别26个碱基，但当它与mtHSP70形成复合物时，其特异性被放松，并转变为能够切割多种DNA。目前还没有关于分子伴侣HSP70在与50K稳定结合的同时转换酶活性的例子的报道，我们研究了这种活性转换的机制并获得了以下结果。 (1)具有50K相同氨基酸序列基序的100多种归巢核酸内切酶单体均具有针对单一DNA序列的特异性活性。当50K特有的N端200个氨基酸被人为删除时，单一序列特异性核酸酶活性仍然存在，但与mtHSP70的相互作用和序列特异性转换是不可能的。这表明50K最初是一种单体酶，可能在其N末端获得了一个额外的区域，使其能够结合mtHSP70并具有更宽松的序列特异性。 (2)Endo。来自另一种酵母菌株的SuvI是Endo的同源酶，并且在50K氨基酸序列上有两个位置的取代。同源50K单体之间活性没有差异，两个氨基酸差异是沉默取代。与 mtHSP70 形成的复合物放松了两个 50K 的序列特异性，但某些 DNA 序列仅对 SceI 具有特异性，并且不能被 SuvI 切割。该结果表明 mtHSP70 引起氨基酸点突变，而这些突变通常不会导致差异表现为表型差异。除了能够改变50K的底物特异性外，分子伴侣mtHSP70还产生点突变表型变化，表明它在促进酶进化方面发挥着作用。