酵母Ssc1タンパク質とYge1タンパク質の機能的連関に関する研究

酵母Ssc1和Yge1蛋白功能关系的研究

基本信息

批准号：
07780534
负责人：
中井正人
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、酵母ミトコンドリアマトリックスに存在しているHsp70タンパク質であるSsc1タンパク質と、GrpEタンパク質ホモログであるYge1タンパク質が、機能的にどう関連し合っているのか、特に、ミトコンドリアタンパク質前駆体の、ミトコンドリア膜透過過程における、これらのタンパク質の協同的な役割を明らかにすることを、最終目標として研究を進めた。申請者は、既に、酵母ミトコンドリアのマトリクス内で、Ssc1タンパク質とYge1タンパク質がトランジェントな複合体を形成しており、この複合体形成は、たとえばATP等のヌクレオチドの存在によって、解離することをみいだしていた。さらに詳細な生化学的解析を行なうためには、これらのタンパク質を大量に精製することが必要であると考えられた。そこで、本研究は、まず遺伝子操作の手法により、そのC末端部分に、それぞれヒスチジンのタグを導入したSsc1タンパク質、およびYge1タンパク質を遺伝子レベルで作製し、強力なプロモーターの下流に導入して、酵母細胞内に形質転換した。これらの酵母株から、ミトコンドリアマトリクスを調製して、Niイオンを結合させたヒスチジンタグに対するアフィニティカラムにより、これらのタンパク質の大量精製を試みた。その結果、いずれの場合においても、ヒスチジンタグを付加したこれらのタンパク質が、効率よく精製された。また、さらに純度を上げるために、イオン交換カラムクロマトグラフィーとの組み合わせることにより、これらのタンパク質をほぼ純粋に精製することに成功した。現在、精製したこれらタンパク質について、相互作用の解析を進めている。

在这项研究中，我们研究了 Ssc1 蛋白（一种存在于酵母线粒体基质中的 Hsp70 蛋白）和 Yge1 蛋白（一种 GrpE 蛋白同源物）如何在功能上相互关联。这项研究的最终目标是阐明协同作用。这些蛋白质在渗透过程中的作用。申请人已经发现Ssc1和Yge1蛋白在酵母线粒体基质内形成瞬时复合物，并且该复合物形成因核苷酸(例如ATP)的存在而解离。为了进行更详细的生化分析，有必要大量纯化这些蛋白质。因此，在本研究中，我们首先利用基因工程技术在基因水平上创建了Ssc1和Yge1蛋白，每个蛋白的C末端区域都引入了组氨酸标签，将它们引入强启动子的下游，然后转化到细胞中。从这些酵母菌株制备线粒体基质，并尝试使用与 Ni 离子结合的组氨酸标签的亲和柱大规模纯化这些蛋白质。结果，在所有情况下，这些组氨酸标签蛋白都得到了有效纯化。此外，为了进一步提高纯度，我们通过与离子交换柱层析相结合，成功地将这些蛋白质纯化至接近纯度。我们目前正在分析这些纯化蛋白质的相互作用。