酵母Ssc1タンパク質とYge1タンパク質の機能的連関に関する研究

酵母Ssc1和Yge1蛋白功能关系的研究

基本信息

批准号：
07780534
负责人：
中井正人
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、酵母ミトコンドリアマトリックスに存在しているHsp70タンパク質であるSsc1タンパク質と、GrpEタンパク質ホモログであるYge1タンパク質が、機能的にどう関連し合っているのか、特に、ミトコンドリアタンパク質前駆体の、ミトコンドリア膜透過過程における、これらのタンパク質の協同的な役割を明らかにすることを、最終目標として研究を進めた。申請者は、既に、酵母ミトコンドリアのマトリクス内で、Ssc1タンパク質とYge1タンパク質がトランジェントな複合体を形成しており、この複合体形成は、たとえばATP等のヌクレオチドの存在によって、解離することをみいだしていた。さらに詳細な生化学的解析を行なうためには、これらのタンパク質を大量に精製することが必要であると考えられた。そこで、本研究は、まず遺伝子操作の手法により、そのC末端部分に、それぞれヒスチジンのタグを導入したSsc1タンパク質、およびYge1タンパク質を遺伝子レベルで作製し、強力なプロモーターの下流に導入して、酵母細胞内に形質転換した。これらの酵母株から、ミトコンドリアマトリクスを調製して、Niイオンを結合させたヒスチジンタグに対するアフィニティカラムにより、これらのタンパク質の大量精製を試みた。その結果、いずれの場合においても、ヒスチジンタグを付加したこれらのタンパク質が、効率よく精製された。また、さらに純度を上げるために、イオン交換カラムクロマトグラフィーとの組み合わせることにより、これらのタンパク質をほぼ純粋に精製することに成功した。現在、精製したこれらタンパク質について、相互作用の解析を進めている。

在这项研究中，我们以最终目标进行了研究，以阐明SSC1蛋白是酵母线粒体基质中发现的HSP70蛋白以及YGE1蛋白（GRPE蛋白的同源物）在功能上相关的YGE1蛋白，尤其是MITochochrial Protistrial Provistrial prokursorial Membrowane Membrowane Membrowane intraneCombrowane contrane coolserative。申请人已经发现，在酵母线粒体基质中，SSC1和YGE1蛋白会形成瞬态复合物，并且该复合物形成可以通过核苷酸（例如ATP）的存在分离。人们认为，为了进行更详细的生化分析，有必要大量纯化这些蛋白质。因此，在这项研究中，首先，在SSC1蛋白和YGE1蛋白的C-末端部分引入了组氨酸标签的SSC1蛋白，分别在基因水平上产生，然后在强大启动子的下游引入，并转化为酵母细胞。从这些酵母菌菌株中制备了线粒体基质，并试图通过与Ni离子结合的组氨酸标签的亲和力柱进行大量纯化这些蛋白质。结果，在每种情况下，这些带有组氨酸标签的蛋白质都是有效纯化的。此外，为了进一步提高纯度，这些蛋白几乎通过将它们与离子交换柱色谱结合在一起而成功地纯化了。目前，我们正在对这些纯化蛋白质的相互作用进行分析。