ユビキチンプロテアソームシステムの応用による癌遺伝子ワクチンの開発研究

应用泛素蛋白酶体系统研发癌症基因疫苗

• 批准号: 15025255
• 负责人: 姫野 國祐
• 金额: $ 2.62万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15025255/
• 关键词: DNAワクチン; メラノーマ; フュージョンDNA; TRP-2; ユビキチン融合遺伝子; CD8^+T細胞; プロテアソーム阻害剤; PA28ノックアウトマウス

近年、田中等によりペプチド抗原をユビキチン化することにより、その抗原がプロテアソームでプロセッシングを受け必然的にMHCクラスI分子に提示されるため抗原特異的CD8+T細胞が効率よく誘導されることが証明された(Immune.Rev.:163;161-76,1998)1)本申請研究ではまずマウスメラノーマ由来のTRP-2遺伝子とユビキチン遺伝子の融合遺伝子(フュージョンDNA)を構築した。(なお、メラノーマ以外にマウス肺癌(3LL)およびマウス消化管(colon26)を用いて同様の研究を行っている)2)in vivoの動物実験の前に構築したワクチンベクターを様々な細胞株に遺伝子導入を行って発現の確認を行い、抗原蛋白のプロセッシングおよび抗原提示機構を解析した。この目的のためプロテアソーム阻害剤であるMG-132、エポキソマイシン等を用いて、抗原蛋白質のプロセッシングにおけるプロテアソームの役割について確認を行った。3)上記フュージョンDNA(メラノーマにおいてはubiqitin-TRP-2遺伝子(以下pcUB-TRP-2))を用いてC57BL/6マウスにDNAワクチンを一週間毎に3度行った。ワクチンは生体への遺伝子導入効率の優れた遺伝子銃を用いた。最終ワクチン終了後2週間目にC57BL/6マウス由来のB16メラノーマを移植した。腫瘍増殖に程度を系に知的に計測した。TRP-2遺伝子でワクチンした宿主マウスでは腫瘍増殖抑制効果は全く認められず腫瘍は増殖を続け、40日目までに全マウスが腫瘍死した。一方、pcUB-TRP-2遺伝子によりワクチンを受けた宿主マウスでは移植腫瘍の増殖は顕著に抑制された。4)このフュージョンDNAによるワクチンを受けたC57BL/6マウスではB16メラノーマの転移も著しく抑制され、強い抗腫瘍免疫が誘導されていることがこの現象から確認された。5)上記ワクチンによる抗腫瘍効果はTRP-2特異的なCD8^+キラーT細胞により担当されていることが証明された。なお、この実験系はCD4^+T細胞の関与は認められなかった。6)上記ワクチンによる抗腫瘍免疫はproteasome activatorであるPA28α/βをノックアウトしたマウスでは誘導されたことによりユビキチンプロテアソーム経路へTRP-2抗原が効率よく提示され、活性の強いCD8^+キラーT細胞が誘導されることが証明された。7)ユビキチンプロテアソーム経路の応用による抗腫瘍効果の誘導はマウス肺癌の系でも認められた。

近年来，Tanaka 等人证明，通过泛素化肽抗原，可以有效诱导抗原特异性 CD8+ T 细胞，因为抗原经过蛋白酶体加工并不可避免地呈递给 MHC I 类分子。 (Immune.Rev.:163;161-76,1998)1) 在这项拟议的研究中，我们首先构建了 TRP-2 基因和源自小鼠黑色素瘤的泛素基因之间的融合基因（融合 DNA）。 （除了黑色素瘤，类似的研究也在利用小鼠肺癌（3LL）和小鼠胃肠道（colon26）进行。）2）在体内动物实验之前构建的疫苗载体用于将基因注射到各种细胞系中。我们确认了表达并分析了抗原蛋白的加工和抗原呈递机制。为此，我们使用MG-132和epoxomicin等蛋白酶体抑制剂来确认蛋白酶体在加工抗原蛋白中的作用。 3)使用上述融合DNA(黑色素瘤中的泛素-TRP-2基因(以下称为pcUB-TRP-2))，每周对C57BL/6小鼠进行3次DNA疫苗接种。该疫苗使用基因枪，具有出色的基因转移效率。最后一次疫苗接种两周后，移植来自 C57BL/6 小鼠的 B16 黑色素瘤。智能地测量肿瘤生长的程度。在接种TRP-2基因的宿主小鼠中，没有观察到肿瘤生长抑制作用，肿瘤继续生长，到第40天时所有小鼠均死亡。另一方面，在接种了pcUB-TRP-2基因的宿主小鼠中，移植肿瘤的生长受到显着抑制。 4)在接受该融合DNA疫苗的C57BL/6小鼠中，B16黑色素瘤的转移也被显着抑制，这一现象证实了诱导了强抗肿瘤免疫。 5) 证明上述疫苗的抗肿瘤作用是由TRP-2特异性CD8^+杀伤T细胞介导的。在此实验系统中，未观察到 CD4^+ T 细胞的参与。 6）上述疫苗诱导的抗肿瘤免疫在蛋白酶体激活剂PA28α/β被敲除的小鼠中诱导，导致TRP-2抗原有效呈递至泛素蛋白酶体途径，并激活高活性的CD8^ + 杀伤性T细胞已被证明是诱导的。 7) 在小鼠肺癌系统中也观察到通过应用泛素蛋白酶体途径诱导抗肿瘤作用。

项目成果

M.Zhang, K.Himeno et al.: "Melanoma immunotherapy by a DNA vaccine based on the ubiquitin-proteasome pathway."Gene Therapy. (in press). (2004)

M.Zhang、K.Himeno 等人：“通过基于泛素-蛋白酶体途径的 DNA 疫苗进行黑色素瘤免疫治疗。”基因治疗。

YI.Seki, K.Himeno et al.: "SOCS-3 regulates onset and maintenance of T(H)2-mediated allergic responses."Nature Medicine. 9・8. 1047-1054 (2003)

YI.Seki、K.Himeno 等人：“SOCS-3 调节 T(H)2 介导的过敏反应的发生和维持。”《自然医学》9·8 (2003)。

K.Onishi, K.Himeno et al.: "Cathepsin L is crucial for Th1-type immune response during Leishmania major infection."Microbes and Infection. (in press). (2004)

K.Onishi、K.Himeno 等人：“组织蛋白酶 L 对于利什曼原虫重大感染期间的 Th1 型免疫反应至关重要。”微生物与感染。

S.Hamano, K.Himeno et al.: "WSX-1 is required for resistance to Trypanosoma cruzi infection by regulation pro-inflammatory cytokine production."Immunity. 19・5. 657-667 (2003)

S. Hamano、K. Himeno 等人：“WSX-1 是通过调节促炎细胞因子的产生来抵抗克氏锥虫感染所必需的。”19・5 (2003)。

Y.Li, K.Himeno et al.: "IL-18 gene therapy develops Th1-type immune responses in Leishmania major-infected BALB/c mice : is the effect mediated by the CpG signaling TLR9?"Gene Therapy. (in press). (2004)

Y.Li、K.Himeno 等人：“IL-18 基因治疗在利什曼原虫重度感染的 BALB/c 小鼠中产生 Th1 型免疫反应：这种效应是由 CpG 信号传导 TLR9 介导的吗？”基因治疗。