ユビキチンプロテアソームシステムの応用による癌遺伝子ワクチンの開発研究

应用泛素蛋白酶体系统研发癌症基因疫苗

• 批准号: 15025255
• 负责人: 姫野 國祐
• 金额: $ 2.62万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15025255/
• 关键词: DNAワクチン; メラノーマ; フュージョンDNA; TRP-2; ユビキチン融合遺伝子; CD8^+T細胞; プロテアソーム阻害剤; PA28ノックアウトマウス

近年、田中等によりペプチド抗原をユビキチン化することにより、その抗原がプロテアソームでプロセッシングを受け必然的にMHCクラスI分子に提示されるため抗原特異的CD8+T細胞が効率よく誘導されることが証明された(Immune.Rev.:163;161-76,1998)1)本申請研究ではまずマウスメラノーマ由来のTRP-2遺伝子とユビキチン遺伝子の融合遺伝子(フュージョンDNA)を構築した。(なお、メラノーマ以外にマウス肺癌(3LL)およびマウス消化管(colon26)を用いて同様の研究を行っている)2)in vivoの動物実験の前に構築したワクチンベクターを様々な細胞株に遺伝子導入を行って発現の確認を行い、抗原蛋白のプロセッシングおよび抗原提示機構を解析した。この目的のためプロテアソーム阻害剤であるMG-132、エポキソマイシン等を用いて、抗原蛋白質のプロセッシングにおけるプロテアソームの役割について確認を行った。3)上記フュージョンDNA(メラノーマにおいてはubiqitin-TRP-2遺伝子(以下pcUB-TRP-2))を用いてC57BL/6マウスにDNAワクチンを一週間毎に3度行った。ワクチンは生体への遺伝子導入効率の優れた遺伝子銃を用いた。最終ワクチン終了後2週間目にC57BL/6マウス由来のB16メラノーマを移植した。腫瘍増殖に程度を系に知的に計測した。TRP-2遺伝子でワクチンした宿主マウスでは腫瘍増殖抑制効果は全く認められず腫瘍は増殖を続け、40日目までに全マウスが腫瘍死した。一方、pcUB-TRP-2遺伝子によりワクチンを受けた宿主マウスでは移植腫瘍の増殖は顕著に抑制された。4)このフュージョンDNAによるワクチンを受けたC57BL/6マウスではB16メラノーマの転移も著しく抑制され、強い抗腫瘍免疫が誘導されていることがこの現象から確認された。5)上記ワクチンによる抗腫瘍効果はTRP-2特異的なCD8^+キラーT細胞により担当されていることが証明された。なお、この実験系はCD4^+T細胞の関与は認められなかった。6)上記ワクチンによる抗腫瘍免疫はproteasome activatorであるPA28α/βをノックアウトしたマウスでは誘導されたことによりユビキチンプロテアソーム経路へTRP-2抗原が効率よく提示され、活性の強いCD8^+キラーT細胞が誘導されることが証明された。7)ユビキチンプロテアソーム経路の応用による抗腫瘍効果の誘導はマウス肺癌の系でも認められた。

近年来，田中等人对肽抗原的泛素化。事实证明，抗原特异性CD8+ T细胞可以通过蛋白酶体加工对肽抗原的泛素化有效诱导，并且抗原特异性CD8+ T细胞在蛋白酶体中进行处理，并且必须呈现给MHC I类分子（Immune.rev.：1633;163;163;161-761-76，1998）1）。在这项申请研究中，首先构建了源自小鼠黑色素瘤的TRP-2基因和泛素基因之间的融合基因（融合DNA）。 （除黑色素瘤外，还使用小鼠肺癌（3LL）和小鼠胃肠道（CoLON26）进行了类似的研究。2）2）在体内动物实验之前构建的疫苗向量的基因转移到各种细胞系中以确认表达，并进行抗原蛋白质和机制的处理。为此，使用蛋白酶体抑制剂MG-132，环霉素等确认了蛋白酶体在抗原蛋白质加工中的作用。 3）C57BL/6小鼠使用上述融合DNA每周三次接受DNA疫苗（对于黑色素瘤，Ubiqitin-Trp-2基因（以下称为PCUB-TRP-2））。该疫苗是一种基因枪，在基因转移到生物体中具有出色的效率。最终疫苗完成两周后，移植了来自C57BL/6小鼠的B16黑色素瘤。智能地智能地测量了肿瘤生长的程度。用TRP-2基因接种的宿主小鼠对肿瘤生长抑制没有影响，肿瘤持续生长，到第40天，所有小鼠都死于肿瘤。另一方面，在具有PCUB-TRP-2基因的宿主小鼠疫苗中，移植肿瘤的生长得到了显着抑制。 4）这种现象证实，用这种融合DNA在C57BL/6小鼠疫苗中明显抑制了B16黑色素瘤转移，并诱导了强抗肿瘤免疫。 5）已经证明，疫苗的抗肿瘤作用是由TRP-2特异性CD8^+杀手T细胞处理的。此外，没有发现CD4^+T细胞参与该实验系统。 6）在小鼠中诱导了疫苗的抗肿瘤免疫，从而击倒了蛋白酶体激活剂PA28α/β，因此将TRP-2抗原有效地呈现给了泛素蛋白酶体途径，表明诱导了高度活跃的CD8^+杀手T细胞。 7）在小鼠肺癌系统中还观察到通过应用泛素蛋白酶体途径诱导抗肿瘤作用。

项目成果

M.Zhang, K.Himeno et al.: "Melanoma immunotherapy by a DNA vaccine based on the ubiquitin-proteasome pathway."Gene Therapy. (in press). (2004)

M.Zhang、K.Himeno 等人：“通过基于泛素-蛋白酶体途径的 DNA 疫苗进行黑色素瘤免疫治疗。”基因治疗。

K.Onishi, K.Himeno et al.: "Cathepsin L is crucial for Th1-type immune response during Leishmania major infection."Microbes and Infection. (in press). (2004)

K.Onishi、K.Himeno 等人：“组织蛋白酶 L 对于利什曼原虫重大感染期间的 Th1 型免疫反应至关重要。”微生物与感染。

YI.Seki, K.Himeno et al.: "SOCS-3 regulates onset and maintenance of T(H)2-mediated allergic responses."Nature Medicine. 9・8. 1047-1054 (2003)

YI.Seki、K.Himeno 等人：“SOCS-3 调节 T(H)2 介导的过敏反应的发生和维持。”《自然医学》9·8 (2003)。

S.Hamano, K.Himeno et al.: "WSX-1 is required for resistance to Trypanosoma cruzi infection by regulation pro-inflammatory cytokine production."Immunity. 19・5. 657-667 (2003)

S. Hamano、K. Himeno 等人：“WSX-1 是通过调节促炎细胞因子的产生来抵抗克氏锥虫感染所必需的。”19・5 (2003)。

Y.Li, K.Himeno et al.: "IL-18 gene therapy develops Th1-type immune responses in Leishmania major-infected BALB/c mice : is the effect mediated by the CpG signaling TLR9?"Gene Therapy. (in press). (2004)

Y.Li、K.Himeno 等人：“IL-18 基因治疗在利什曼原虫重度感染的 BALB/c 小鼠中产生 Th1 型免疫反应：这种效应是由 CpG 信号传导 TLR9 介导的吗？”基因治疗。