ジーントラップ・マイクロアレイを利用した感染宿主応答の分子遺伝学的解析

使用基因捕获微阵列对受感染宿主反应进行分子遗传学分析

基本信息

批准号：
15019065
负责人：
石田靖雅
金额：
$ 3.2万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、新しいゲノム科学の手法をマウス樹状細胞の研究に応用することにより、感染宿主の免疫応答を分子遺伝学的に解析している。本年度は、マウスのES細胞RETジーントラップ・ベクター(改良型poly Aトラップ方式を採用)を利用してランダムなジーントラップを行い、これまでに約2000個のES細胞コロニーをピックアップした。それぞれのES細胞クローンからRNAを抽出し、3'RACE法によりトラップされた遺伝子のcDNA断片を増幅したあと、その塩基配列を決定した。その情報に基づき、それぞれの遺伝子に特異的なPCRプライマーを合成し、さらに高純度のcDNA断片を増幅し、DNAアレイを作製した。このアレイを用いたスクリーニングにおいて、マウスの脳で持異的に発現する新規遺伝子を見出し、その遺伝子がトラップされたES細胞クローンを用いることにより、直ちにその新規遣伝子に関するノックアウト・マウスを作製した。このことは、ランダムなジーントラップに基づいたDNAアレイを用いることにより、遺伝子の発現パターンのみを指標にして(その塩基配列には依存せず)全く新規の遺伝子群を同定し、直ちにそれらをマウスの個体レベルでノックアウトすることが可能である、ということを証明している(Matsuda, E.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101,4170-4174,2004)。上記のDNAアレイを用い、現在、異なった分化段階にあるマウス樹状細胞で特異的に発現されている遺伝子群を同定中である。これとは別に、我々のジーントラップES細胞ストックの中にマウスのGelectin-7およびInterleukin-17D遺伝子がトラップされたクローンが発見されたため、それらを用いてノックアウト・マウスを作製中である。

在这项研究中，我们将新的基因组科学技术应用于小鼠树突细胞的研究，并分子遗传分析感染宿主的免疫反应。今年，我们使用小鼠ES细胞RET基因陷阱向量进行了随机基因陷阱（使用改进的聚A陷阱方法），到目前为止，我们已经捡起了大约2,000个ES细胞菌落。从每个ES细胞克隆中提取RNA，并通过3'race方法扩增被捕获基因的cDNA片段后，确定了碱基序列。基于这些信息，合成了针对每个基因的PCR引物，并将高纯度cDNA片段放大以创建DNA阵列。在使用此阵列筛选时，发现了一种在小鼠大脑中透射表达的新型基因，并通过使用将基因捕获的ES细胞克隆，立即为新基因生成基因敲除小鼠。这证明，通过使用基于基因陷阱的随机DNA阵列，可以使用基因表达模式作为指示器（无核苷酸序列依赖性）鉴定完全新颖的基因组，并立即将它们击倒在单个小鼠级别（Matsuda，E。E.等，Proc。Natl。Natl。Acad。Sci。SCI。SACI。USA101,4170-4170-4170-4174,4174,2004）。使用上述DNA阵列，我们目前正在识别在分化不同阶段的小鼠树突细胞中特异性表达的基因。另外，已经发现了被困在我们基因陷阱ES细胞库存中的小鼠胶蛋白7和白介素17D基因的克隆，我们正在使用它们来产生敲除小鼠。