ジーントラップ・マイクロアレイによるマウス・ゲノムの網羅的な機能解析

使用基因捕获微阵列对小鼠基因组进行综合功能分析

基本信息

批准号：
15011237
负责人：
石田靖雅
金额：
$ 3.46万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15011237/
关键词：
ジーントラップ DNAアレイマウス ES細胞ノックアウト NAISTrap ゲノム機能解析

项目摘要

我々は、マウス・ゲノム科学における新しい研究手法の開発を第一の目標にし、本研究を推進している。まず、マウスのES細胞とレトロウイルス型ジーントラップ・ベクターRET(改良型poly Aトラップ方式を採用)を利用してランダムなジーントラップを行い、これまでに約2000個のES細胞コロニーをピックアップした。それぞれのES細胞クローンからRNAを抽出し、3'RACE法によりトラップされた遺伝子のcDNA断片を増幅したあと、direct sequencingによってその塩基配列を決定した。その塩基配列の情報に基づき、それぞれの遺伝子に特異的なPCRプライマーを合成し、3'RACE法によって得られたものよりもさらに高純度のcDNA断片を増幅し、DNAアレイを作製した。このアレイを用いたスクリーニングにおいて、マウスの脳で特異的に発現する新規遺伝子を見出し、その遺伝子がトラップされたES細胞クローンを用いることにより、直ちにその新規遺伝子に関するノックアウト・マウスを作製した。このランダムなジーントラップに基づいたDNAアレイの大きな特徴は、従来のゲノム解析法では遺伝子として見なされたことのない、未知の(unknown)遺伝子候補配列を数多く含んでいることである。我々のアレイを用いたスクリーニングでは、このような遺伝子候補配列の場合でも、しばしばマウスの組織におけるmRNAレベルでの発現を確認することができた。つまり、ランダムなジーントラップに基づいたDNAアレイを用いることにより、遺伝子の発現パターンのみを指標にして(その塩基配列には依存せず)全く新規の遺伝手群を同定し、直ちにそれらをマウスの個体レベルでノックアウトすることが可能になったのである。この新しい手法の開発により、マウス・ゲノムの網羅的な機能解析の分野に大きな突破口が切り開かれた、と言うことができる。

我们以我们在小鼠基因组科学中开发新的研究方法的主要目标来促进这项研究。首先，使用小鼠ES细胞和逆转录病毒基因陷阱载体RET进行随机基因陷阱（采用改进的聚A陷阱方法），并最新拾取了大约2,000个ES细胞菌落。从每个ES细胞克隆中提取RNA，通过3'race方法扩增了捕获基因的cDNA片段，并通过直接测序确定碱基序列。根据基础序列的信息，合成了针对每个基因的PCR引物，并且比通过3'Race方法获得的纯度更高的cDNA片段被放大以产生DNA阵列。在使用此阵列进行筛选时，发现了一种特异性在小鼠大脑中表达的新基因，并通过使用将基因捕获的ES细胞克隆，立即生成新基因的基因敲除小鼠。此随机基因陷阱的DNA阵列的主要特征是它包含许多未知基因候选序列，这些序列在常规基因组分析方法中尚未被视为基因。即使在这种基因候选序列的情况下，我们的阵列筛选使我们能够在小鼠组织中确认在小鼠组织中的表达。换句话说，通过使用基于随机基因陷阱的DNA阵列，仅使用基因表达模式（不依赖其碱基序列）鉴定全新的遗传组，并立即将其击倒在小鼠个体级别上。这种新方法的发展为小鼠基因组的综合功能分析领域开辟了重大突破。