ジーントラップ法による神経変異マウスの作製と表現型解析

使用基因陷阱方法创建神经突变小鼠并进行表型分析

• 批准号: 05J02814
• 负责人: 重岡 稔章
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J02814/
• 关键词: ジーントラップ; ES細胞; ノックアウトマウス; NMD; 神経変異マウス; DNAアレイ

1、Gene Trap Microarray法による神経系遺伝子の破壊ジーントラップ法によりマウスES細胞を標的としたランダムな変異体作製を行い、新たに多数のクローンの変異体ES細胞クローンを単離、凍結した。3'RACE法によりトラップベクターのゲノム上の挿入部位を決定した結果、神経組織で特異的に発現する遺伝子が多数破壊されていることが確認された。また、変異体クローン中で破壊されている未知遺伝子をプローブとして載せたDNAアレイを作製し、発現解析が行われた。2、ジーントラップ法の改良本研究で用いられている新しいジーントラップ法(UPATrap法)では、mRNA上に存在するIRES(internal ribosome entry site)がNMD(Nonsense mediated mRNA decay)を抑制するという原理が応用されている。これにより、標的細胞における遺伝子発現の有無に関わらず遺伝子を破壊することに成功している。しかし、その一方で作製された変異マウスにおいて、IRESの働きにより異常はタンパク質が合成されるという欠点が存在することが明らかになった。NMDの抑制機構について解析した結果、mRNA上の二次構造がNMD抑制に重要であることが判明し、ジーントラップベクター内に使用されているIRESを他の二次構造を形成する配列で代用可能であることを明らかにした。この改良型ベクターを用いることにより、効率的な遺伝子破壊が可能であることが示された。この研究成果については、第20回国際生化学・分子生物学会議(京都2006)においてポスター発表を行っている。

1。使用基因陷阱微阵列方法基因陷阱破坏神经系统基因，用于创建靶向小鼠ES细胞的随机突变体，并分离并冷冻许多新的突变体ES细胞克隆。陷阱载体基因组上的插入位点由3'Race方法确定，并证实许多在神经组织中特异性表达的基因已被破坏。此外，制备了DNA阵列，其中将被破坏在突变克隆中的未知基因安装为探针，并进行了表达分析。 2。基因陷阱法的改进本研究中使用的新基因陷阱法（UPATRAP方法）使用了mRNA上存在的内部核糖体入口位点（IRES）的原则，抑制了胡说八道的介导的mRNA衰变（NMD）。无论基因表达是否存在于靶细胞中，这都可以成功破坏基因。但是，已经揭示了在产生的突变小鼠中，异常是由IRES的作用综合的。对NMD抑制机制的分析表明，mRNA上的二级结构对于NMD抑制很重要，并发现在基因载体中使用的IRE可以用形成其他二级结构的序列代替。使用这种改进的矢量已显示出可有效的基因破坏。这项研究结果是在第20届国际生物化学和分子生物学会议上的海报中提出的（Kyoto 2006）。