抗リン酸化ペプチド抗体を用いた細胞周期制御機構の可視化

使用抗磷酸化肽抗体可视化细胞周期控制机制

基本信息

批准号：
20058009
负责人：
上田宏
金额：
$ 3.07万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は(1)FRET法による細胞骨格微小管蛋白ビメンチンのリン酸化検出プローブの最適化,ならびに(2)抗体可変領域の抗原による安定化を利用した新規イメージング法の開発を目標に研究を行った。(1)では前年度に得られた、細胞周期によりそのリン酸化が制御されるビメンチンのセリン71リン酸化認識抗体TM71発現系を用い、オープンサンドイッチ(OS)法によるリン酸化検出を試みた。VH/VL相互作用に影響を与えるH39への変異導入によりOS-ELISAの応答性(S/B比)が顕著に向上したため,この変異体VHならびにVLをTrx融合蛋白質として酸化的細胞質を持つ大腸菌で発現させ,それぞれAlexa488とRhodamineXで蛍光ラベルし混合して試験管内で蛍光スペクトルを測定した。この結果,抗原ペプチド依存的な最大18%の蛍光強度比変化が得られた。これを電気穿孔法によりU251細胞に導入し,高感度カメラを用いて蛍光顕微鏡観察したところcleavage furrowへの局在と若干のFRET比の変化が見られた。現在各種条件で追試を行っている。(2)では,抗原結合により蛍光強度が増強する新規蛍光ラベル化抗体"Quenchbody"の開発に成功した。具体的には,無細胞タンパク質合成系を用いて抗体VHのN末端近傍に蛍光ラベルをピンポイント導入することで,複数の低分子抗原認識FvあるいはscFvにおいて共存する抗原濃度依存的に蛍光強度が最大6倍増大する現象を発見した。メカニズムは現在解析中であるが,VH/VL界面に存在する複数のTrp残基の変異で抗原非存在時の蛍光強度が増大することから,これらの残基による蛍光のクエンチが重要であり,これが抗原結合に伴うFv安定化により解消することが考えられる。FRET法に比べて応答性に優れるこの方法を,今後各種細胞内リン酸化検出系に応用していきたい。

今年，我们进行了研究，目的是（1）优化使用FRET方法的细胞骨架微管蛋白波形蛋白的磷酸化检测探针，以及（2）开发一种新型成像方法，该方法利用基于抗原的抗体可变区域的稳定化。在（1）中，我们尝试使用波形蛋白的TM71表达系统通过开放式三明治（OS）方法检测磷酸化，该系统的磷酸化由上一年获得的细胞周期控制。影响VH/VL相互作用的H39的诱变显着提高了OS-ELISA的响应性（S/B比），因此突变的VH和VL表示为E. coli中的TRX融合蛋白，氧化细胞质和荧光量与AlexA488888888和晶状体相应地将其混合在一起。这导致荧光强度比的抗原依赖性变化高达18％。通过电穿孔将其引入U251细胞中，并使用荧光显微镜使用高敏感摄像头观察到，并显示出对裂解沟的定位，并在FRET比的情况下进行了轻微的变化。目前，我们正在各种条件下进行反击。在（2）中，我们成功地开发了一种新型的荧光标记的抗体“ Quenchby”，从而增强了由于抗原结合而引起的荧光强度。具体而言，我们发现，通过使用无细胞蛋白质合成系统来确定抗体VH N末端附近的荧光标签，荧光强度以浓度依赖性方式增加了6次，其中多种小分子抗原识别FV或SCFV共存。该机制目前正在分析中，但是在缺乏抗原的情况下，存在VH/VL界面处的多个TRP残基的突变会增加荧光强度，因此这些残基对荧光进行淬灭很重要，并且认为这将通过FV稳定而解决，并伴随FV稳定。这种方法比FRET方法更快，希望将其应用于将来的各种细胞内磷酸化检测系统。