生理的条件で特異的配列が検出可能な核酸センサー蛋白質の創出

创建可以在生理条件下检测特定序列的核酸传感器蛋白

基本信息

批准号：
17656264
负责人：
上田宏
金额：
$ 2.18万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでハイブリダイゼーション原理に基づくDNAセンサーの報告は数多いが,生理的条件特に生細胞内で二本鎖DNAを認識,検出することは極めて困難であった。本研究においては二本鎖DNAの特異的認識ユニットとしてZinc fingerタンパク質を用い,二個のZinc finger同士が細胞内の特異的配列の存在下二量体を形成した際にこれを蛍光強度などで検出することで特異的配列を持つ菌体を検出,選択する新規な手法の開発を目指した。昨年度までに二量体形成促進ペプチドのついたZif268由来の2個のZinc fingerの下流に,蛍光蛋白質であるeYFPを二個に分割したYNあるいはYCを結合させた二種類の蛋白質を同一大腸菌内で発現させることで,これらの特異的配列DNA依存的な近接の結果eYFPのfoldingおよび蛍光団形成が誘起されて細胞あたりの蛍光強度が顕著に強まることを確認した。しかしこの系ではZinc finger部分の配列特異性が8bp程度と甘いことも同時に明らかとなり,プラスミド上に14コピー程度の特異的配列リピートをもつ菌体でないと蛍光分光光度計およびフローサイトメトリーを用いて再現性のよい検出ができない問題も明らかとなった。そこで今年度はさらに片方のセンサータンパク質にZifドメインを1個追加し,認識配列を長くすることで染色体DNA中にある認識配列由来と思われるバックグラウンド蛍光を減らし,結果pUC19上の1コピーの13bpの認識配列を再現性よく検出することに成功した(20^<th>IUBMB International Congress, 2007/6,京都および2006年度日本生物工学会大会にて発表)。以上より当初の目的である生理的条件で特異的配列が検出可能な核酸センサー蛋白質が創出できたと考えられ,現在投稿論文としてまとめるために比較として試験管内再構成の実験を行っている。

尽管已经有许多基于杂交原理的DNA传感器的报道，但到目前为止，在生理条件下，尤其是在活细胞中，很难识别和检测双链DNA。在这项研究中，我们将锌指蛋白用作双链DNA的特定识别单元，并旨在通过使用荧光强度或类似的荧光强度来检测它们在细胞中检测到细胞中的特定序列，以检测两个锌指在细胞中的特定序列中检测到具有特定序列的新方法来检测和选择具有特定序列的细菌。通过表达两种类型的蛋白质，其中将荧光蛋白EYFP分为源自ZIF268的锌指的下游两个部分，ZIF268在同一大肠杆菌中具有二聚体促进的肽，它证实了这些特定的序列DNA依赖性依赖性的折叠和荧光孔形成，这是相互依赖的，该序列依赖于Eyeroplore的形成，该图是显着增强的。然而，还发现该系统中锌指部分的序列特异性在约8 bp的情况下很小，也发现，除非使用荧光分光光度计和流式细胞仪检测可重复检测，除非细胞在质粒上具有约14份的特定序列重复序列。因此，今年，我们在一个传感器蛋白中添加了一个ZIF结构域，并延长了识别顺序，以减少似乎源自染色体DNA中的识别顺序的背景荧光，结果，我们成功地检测到了一个13 BP识别序列，以puc19的方式在puc19上以典型的方式（在IUBBMB国际委员会中及其2007年），及6月在2007年，在2007年，在2007年，Kyot and of the Iub bb society and oprocation and。生物工程会议）。从以上，可以认为能够在原始生理条件下检测特定序列的核酸传感器蛋白可以创建，并且目前正在进行体外重建实验，以相对总结为提交的论文。