細胞内抗原高感度検出素子の創製

高灵敏细胞内抗原检测元件的研制

基本信息

批准号：
18038009
负责人：
上田宏
金额：
$ 1.02万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

抗体は万能分子認識素子としてプロテオーム解析ツールとしても大きく期待される一方,生理的条件の細胞質は還元条件であるため,各ドメインのフォールディングに必須なSS結合が出来ず,従来抗体を生細胞細胞質で機能させることは困難と考えられてきた。そこで我々は分子内シャペロン活性のあるマルトース結合蛋白質(MBP)との融合発現により,還元的細胞質においてファージライブラリから選択した一本鎖抗体を機能的に発現させ,生細胞内で抗原を検出できないか試みた。本年度はモデル抗原として活性検出の容易な転写制御因子の一つDR1を用い,GST-DR1を大腸菌で発現してこれを用いたヒト型一本鎖抗体ファージライブラリのスクリーニングによりDRI特異的クローン3種を得た。そこでこれらをMBPおよびGFPとの融合タンパク質としてCOS-1細胞に発現させ蛍光顕微鏡で観察したところ,結合能の高いクローン2種を導入した細胞質で特徴的な輝点を観察した。そこでDR1を赤色蛍光タンパクmDsRed2と融合させ共発現させたところ,両者の共局在が認められた。またウェスタンブロットにより,MBP-scFv-GFP融合タンパク質は期待された分子量のものが発現していることが確認された。また,これらのベクターとともにTBPを介した転写活性のレポーターとしてSV40あるいはHSP70Aプロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子をもつプラスミドを共導入したところ,Dr1の活性であるTBP依存的転写活性化の抑制(シグナル減少)を,MBP-scFvが抑えていることを示唆する結果を得た。また別の実験で,抗フルオレセインscFvを大腸菌細胞質でMBP融合タンパクとして発現させた場合,細胞内にフルオレセインを導入すると非発現菌より有意に蛍光強度が強まるとの結果を得た。以上より,一般的なファージ抗体ライブラリから取得した一般的な抗体であっても,MBPと融合させることで生細胞内で機能的に発現可能なことが示されたと考えられる。

虽然抗体高度预期是一种通用分子识别装置和蛋白质组分析工具，但在生理上是一种疾病的细胞质是一种降低的条件，而SS结合对于每个域的折叠是必不可少的，并且不可能被认为很难在活细胞中发挥作用。因此，我们尝试用麦芽糖结合蛋白（MBP）与分子内伴侣活性融合表达，以在还原性细胞质中从噬菌体库中选择功能表达单链抗体，并检测活细胞中的抗原。今年，DR1是可以轻松检测活性的转录调节剂之一，用作模型抗原，并通过在Escherichia Coli中使用GST-DR1筛选人类单链抗体噬菌体库来获得三个DRI特异性克隆。因此，这些在COS-1细胞中以MBP和GFP的融合蛋白表示，并在荧光显微镜下观察到，并且在引入两个高度结合克隆的细胞质中观察到了特征亮点。因此，通过与红色荧光蛋白MDSRED2融合共同表达DR1，并且观察到两者的共定位。蛋白质印迹证实，MBP-SCFV-GFP融合蛋白用预期的分子量表达。此外，当这些载体与SV40或HSP70A启动子的下游共同引入，作为TBP介导的转录活性的记者，我们获得了MBP-SCFV的结果，表明MBP-SCFV抑制了TBP依赖性转录激活的TBP抑制（信号降低）。在另一个实验中，当抗氟烯素SCFV表示为大肠杆菌细胞质中的MBP融合蛋白时，荧光素细胞内增加了荧光素强度与非表达细菌相比显着显着增加。从上面可以相信，即使是从一般噬菌体抗体库中获得的一般抗体也可以通过与MBP融合在活细胞中的功能表达。