ヘムプロピオン酸側鎖が関与するヘムタンパク質の高次構造形成と機能発現機序の解明

阐明涉及丙酸血红素侧链的血红素蛋白的高阶结构形成和功能表达机制

• 批准号: 20051015
• 负责人: 林 高史
• 金额: $ 3.97万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20051015/
• 关键词: 蛋白質; 酵素; ヘムタンパク質; ヘム

ヘムタンパク質は、補欠分子であるヘム(鉄ポルフィリン錯体)がタンパク質マトリクスと結合し、様々な機能を発現している生体分子である。このヘムは2本のプロピオン酸側鎖を有し、プロピオン酸側鎖はタンパク質のアミノ酸側鎖と水素結合ネットワークを形成している。今回、ヘムタンパク質の1つであるチトクロムP450camに着目し、そのプロピオン酸側鎖の酵素活性に対する役割の解明を行った。特に、片方のプロピオン酸(7位)と相互作用しているアミノ酸(Asp297)に着目し、変異体D297Lの挙動を検討した。この変異体は、活性が非常に低下し、resting state(休止状態)で存在する基質結合部位の水クラスターが、酵素外部に排出される過程が極めて遅いことを実験及び計算結果から明らかにした。したがって、Asp297は酵素内に存在する水排出は、このプロピオン酸-Asp297のネットワークが深く関与していることを主張するに至った。これまで、チトクロムP450camのカンファー水酸化の触媒反応において、最初のステップである水の排出機構については、殆ど言及されていなかったため、今回の研究成果は今後の酵素中での水の動的役割において、新たな知見を与えるものと期待される。さらに、チトクロムP450camだけでなく、代表的なヘムタンパク質であるHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)についても、ヘムプロピオン酸側鎖の役割解明に着手した。こちらは、2本のプロピオン酸側鎖の片方が欠損した片足ヘムをアポ化したペルオキシダーゼに挿入した再構成タンパク質を調製し、その構造と活性の評価を行った。その結果、6位プロピオン酸は、タンパク質の中でヘムを安定化する重要な働きを示すこと、また活性の制御に役立っていることが明らかとなった。

血红素蛋白是一种生物分子，其中血红素（铁卟啉复合物）作为一种假体分子，与蛋白质基质结合并表达各种功能。这种血红素有两条丙酸侧链，与蛋白质的氨基酸侧链形成氢键网络。这次，我们重点关注细胞色素P450cam（一种血红素蛋白），并阐明其丙酸侧链对酶活性的作用。我们特别关注与一种丙酸（位置 7）相互作用的氨基酸 (Asp297)，并研究了突变体 D297L 的行为。实验和计算表明，该突变体的活性非常低，并且静息状态下存在的底物结合位点中的水簇从酶中排出的过程极其缓慢。因此，Asp297 存在于酶中，并且有人认为这种丙酸-Asp297 网络与水排泄密切相关。迄今为止，很少有人提及水的排泄机制，而水是细胞色素P450cam樟脑羟基化催化反应的第一步，因此本研究结果将有助于阐明水在酶中的动态作用。未来，有望提供新的知识。此外，我们开始阐明丙酸血红素侧链不仅在细胞色素P450cam中的作用，而且在HRP（辣根过氧化物酶）（一种典型的血蛋白）中的作用。在这里，我们制备了一种重构蛋白，其中缺失两个丙酸侧链之一的单足血红素被插入到聚合过氧化物酶中，并评估了其结构和活性。结果表明，6位丙酸在稳定蛋白质中的血红素方面发挥着重要作用，也有助于控制其活性。

项目成果

Handbook of Porphyrin Science

• DOI: 10.1142/11320
• 发表时间: 2019-05
• 期刊: Handbook of Porphyrin Science
• 作者: K. Kadish;Kevin M Smith;R. Guilard

A Role of the Heme-7-Propionate Side Chain in Cytochrome P450cam as a Gate for Regulating the Acess of Water Molecules to the Substrate-Binding Site

细胞色素 P450cam 中血红素 7-丙酸酯侧链作为调节水分子进入底物结合位点的闸门的作用

• 发表时间: 2009
• 期刊: J. Am. Chem. Soc 131
• 作者: 森崎泰弘;中條善樹;Teruyuki Kondo;近藤輝幸;神田崇史;Toshiyuki Moriuchi;Toshiyuki Moriuchi;Toshiyuki Moriuchi;Toshiyuki Moriuchi;孟祥太;二科昌文;森内敏之;二科昌文;野口峻一;Takashi Hayashi
• 通讯作者: Takashi Hayashi

Molecular Mechanism of Water Expelling System in the Initial Step of Cytochrome P450cam Catalytic Cycle

细胞色素P450cam催化循环初始阶段排水系统的分子机制

• 发表时间: 2010
• 作者: 廣田俊;田中直輝;長尾聡;北岸宏亮;加納航冶;I.Micetic;M.Bertamini;L.Bubacco;Keisuke Sakurai;Ritsu Kamiya;岩崎憲治;林高史
• 通讯作者: 林高史

Evaluation of Functional Role of Heme-Proponate Side Chains in Cytochrome P450cam

细胞色素 P450cam 中丙酸血红素侧链的功能作用评估

• 发表时间: 2008
• 作者: T.Hayashi;K.Harada;K.Sakurai;H.Shimada
• 通讯作者: H.Shimada

Substrate binding induces structural changes in cytochrome P450cam

底物结合诱导细胞色素 P450cam 的结构变化

• 发表时间: 2009
• 期刊: Ada. Cryst. F 65
• 作者: Keisuke Sakurai;et.al.
• 通讯作者: et.al.