進化分子工学および金属錯体化学を駆使したヘムタンパク質の触媒機能拡張

利用进化分子工程和金属络合物化学扩展血红素蛋白的催化功能

基本信息

批准号：
22K14783
负责人：
加藤俊介
金额：
$ 3万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、進化分子工学的手法を遷移金属錯体へと応用し、優れた触媒特性を発揮する新規高機能触媒を開発することを目的とする。具体的には、非天然の合成ポルフィリノイドを補因子としてヘムタンパク質に再構成した「人工金属酵素」を構築し、指向性進化法（directed evolution）を駆使した遺伝子工学的な改変を実施する。2022年度は、鉄コロール錯体を補因子としてミオグロビンに導入した人工金属酵素を構築し、指向性進化法によるタンパク質反応場の改変を実施した。ミオグロビンのヘム結合サイトを構成する複数のアミノ酸残基を選定し、部位飽和変異導入（site-saturation mutagenesis）によりランダム化した変異体ライブラリをスクリーニングすることで、ABTSの酸化反応に対して高いペルオキシダーゼ活性を示す変異体を獲得することに成功した。この得られた変異体は、改変前の人工金属酵素と比較して、24倍高い反応初速度を示すことが判明した。加えて、鉄ポルフィセン錯体やコバルトコリン錯体を補因子とする人工金属酵素の開発にも現在着手しており、今後これらの人工金属酵素の指向性進化法による改変も実施する予定である。また、2022年度は、効率的な人工金属酵素の指向性進化を実現するために、オリゴペプチド（Strep-tag II）を精製タグに用いた新たなハイスループットスクリーニング（HTS）手法を確立した。本HTS手法は、安価なキチン粉末をクロマトグラフィー担体として用いて、人工金属酵素の指向性進化を細胞夾雑物非存在下で実現する強力な手法である。今後、このHTS手法を最大限に活用し、進化分子工学による高機能金属酵素の開発に着手する。

本研究的目的是将进化分子工程技术应用于过渡金属配合物，开发具有优异催化性能的新型高性能催化剂。具体来说，我们将构建一种使用非天然合成的卟啉作为辅因子重构为血红素蛋白的“人工金属酶”，并利用定向进化进行基因工程修饰。 2022年，我们构建了一种人工金属酶，将铁咔咯复合物作为辅助因子引入到肌红蛋白中，并利用定向进化方法修饰了蛋白质反应场。通过选择构成肌红蛋白的血红素结合位点的多个氨基酸残基并筛选通过位点饱和诱变随机化的突变体文库，我们成功地实现了针对ABTS的氧化反应的高过氧化物酶活性我们成功地获得了显示出这一点的突变体。。结果发现，与未修饰的人工金属酶相比，所得突变体的初始反应速率高出 24 倍。此外，我们目前正在开发以铁卟啉配合物和钴胆碱配合物作为辅助因子的人工金属酶，并计划在未来使用定向进化方法对这些人工金属酶进行修饰。此外，在2022财年，我们建立了一种新的高通量筛选（HTS）方法，使用寡肽（Strep-tag II）作为纯化标签，以实现人工金属酶的高效定向进化。这种高温超导方法是一种在没有细胞污染物的情况下实现人工金属酶定向进化的强大方法，使用廉价的甲壳素粉末作为色谱载体。未来，我们将充分利用这种高温超导方法，通过进化分子工程开始开发高功能金属酶。