進化分子工学および金属錯体化学を駆使したヘムタンパク質の触媒機能拡張

利用进化分子工程和金属络合物化学扩展血红素蛋白的催化功能

基本信息

批准号：
22K14783
负责人：
加藤俊介
金额：
$ 3万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、進化分子工学的手法を遷移金属錯体へと応用し、優れた触媒特性を発揮する新規高機能触媒を開発することを目的とする。具体的には、非天然の合成ポルフィリノイドを補因子としてヘムタンパク質に再構成した「人工金属酵素」を構築し、指向性進化法（directed evolution）を駆使した遺伝子工学的な改変を実施する。2022年度は、鉄コロール錯体を補因子としてミオグロビンに導入した人工金属酵素を構築し、指向性進化法によるタンパク質反応場の改変を実施した。ミオグロビンのヘム結合サイトを構成する複数のアミノ酸残基を選定し、部位飽和変異導入（site-saturation mutagenesis）によりランダム化した変異体ライブラリをスクリーニングすることで、ABTSの酸化反応に対して高いペルオキシダーゼ活性を示す変異体を獲得することに成功した。この得られた変異体は、改変前の人工金属酵素と比較して、24倍高い反応初速度を示すことが判明した。加えて、鉄ポルフィセン錯体やコバルトコリン錯体を補因子とする人工金属酵素の開発にも現在着手しており、今後これらの人工金属酵素の指向性進化法による改変も実施する予定である。また、2022年度は、効率的な人工金属酵素の指向性進化を実現するために、オリゴペプチド（Strep-tag II）を精製タグに用いた新たなハイスループットスクリーニング（HTS）手法を確立した。本HTS手法は、安価なキチン粉末をクロマトグラフィー担体として用いて、人工金属酵素の指向性進化を細胞夾雑物非存在下で実現する強力な手法である。今後、このHTS手法を最大限に活用し、進化分子工学による高機能金属酵素の開発に着手する。

这项研究旨在开发新的高功能催化剂，通过将进化分子工程方法应用于过渡金属络合物，从而表现出出色的催化特性。具体而言，通过将非天然合成卟啉素作为辅助因子重构为血红素蛋白，并使用定向进化进行基因工程修饰来构建人工金属酶。在2022财年中，使用铁 - 彩洛尔复合物作为辅因子构建人造金属酶进入肌红蛋白，并使用方向性进化方法改变了蛋白质反应场。通过选择构成肌红蛋白血红素结合位点的多个氨基酸残基，并通过位点饱和诱变筛选随机突变库，我们成功地获得了表现出高过氧化物酶活性的突变体，抗ABT的氧化。在修饰前，发现该突变体的初始反应速率比人工金属酶高24倍。此外，我们目前正在使用卟啉配合物和钴胆碱复合物作为辅因子开发人造金属酶，我们计划将来使用定向进化方法对这些人工冶金酶进行修改。此外，在2022年，为了实现人工金属酶的有效定向演化，我们使用寡肽（strep-tag II）作为纯化标签建立了一种新的高通量筛选（HTS）方法。该HTS技术是一种强大的技术，它使用廉价的几丁质粉末作为色谱载体来实现在没有细胞污染物的情况下人工冶金酶的方向演化。将来，我们将充分利用这种HTS方法，并开始使用进化分子工程开发高功能性金属酶。