細胞内で高難度反応の触媒として働く人工金属酵素の創製

创建人造金属酶作为细胞内困难反应的催化剂

• 批准号: 22KJ2064
• 负责人: 香川 佳之
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2064/
• 关键词: 人工金属酵素; ヘムタンパク質; ポルフィセン; C-H結合アミノ化反応; 鉄錯体; シトクロムP450; 鉄; ミオグロビン

本研究では、位置・立体選択的なC-H結合官能基化反応を促進する人工金属酵素の開発と細胞内反応への応用をめざしている。当該年度は人工金属酵素のタンパク質構造に着目し、人工補因子である鉄ポルフィセン錯体と種々のヘムタンパク質やその変異体と複合化し、C-H結合アミノ化反応の活性評価を実施した。まず、鉄ポルフィセン錯体と各種ヘムタンパク質のアポ体を複合化し、分子内C-H結合アミノ化反応に対する触媒活性を評価した。触媒回転数はタンパク質構造により変化し、シトクロムP450BM3 (BM3)と鉄ポルフィセン錯体を複合化した再構成シトクロムP450BM3 (rBM3)が高い触媒回転数を示した。次に、変異導入によるrBM3のタンパク質構造を改変し、高活性化を実施した。具体的には、補因子に配位しているシステインに着目し、19種類の一重変異体について、触媒反応を評価した。その結果、アスパラギン酸に置換した再構成体の変異体(rBM3*)が、rBM3に対して2倍高い触媒回転数を示した。次に、rBM3*の基質結合部位に存在する5つのアミノ酸残基に着目し、rBM3*一重変異体(95種類)とランダム変異導入により得られた多重変異体(約30種)を評価したところ、複数の変異体において、触媒回転数およびエナンチオ選択性が向上する結果を得た。さらに、より高活性な多重変異体の構築に向け、機械学習を使用した変異体の探索を実施した。得られた変異体データを初期データとし、(1)データを用いた機械学習モデルの構築、(2)機械学習による変異体ライブラリの設計、(3)実験による変異体の調製と触媒反応評価を実施した。得られる実験データを加えて、(1)-(3)のサイクルをさらに3回繰り返した。その結果、rBM3*に対して4倍高い触媒回転数を示す変異体の構築を達成した。上記の研究成果の一部は国内の学会にて発表し、高い評価を受けた。

这项研究旨在开发人工金属酶，以促进区域性选择性的C-H键官能化反应，并将其应用于细胞内反应。在今年，我们使用C-H结合胺化反应的活性，使用人造卟啉配合物，一种人造辅助因子将它们与各种血红素蛋白和突变体复杂化。首先，将卟啉复合物和各种血红素蛋白的apoform进行复合，以评估分子内C-H键胺化反应的催化活性。催化旋转速度取决于蛋白质结构，重建的细胞色素P450BM3（RBM3）是细胞色素P450BM3（BM3）和卟啉烯配合物的复合体，显示出高催化旋转速度。接下来，通过诱变改变了RBM3的蛋白质结构以实现高激活。具体而言，评估了19个单个突变体的催化反应，重点是与辅因子协调的半胱氨酸。结果，用天冬氨酸取代的重构产物的突变体（RBM3*）显示出比RBM3高2倍的催化旋转速度。接下来，重点关注RBM3*底物结合位点中存在的五个氨基酸残基，我们评估了RBM3*单个突变体（95种类型）和通过随机诱变获得的多个突变体（约30种类型），并发现催化旋转速度和映射性在多个突变体中得到改善。此外，我们使用机器学习来搜索突变体以构建更多活跃的多重突变体。使用所获得的突变数据作为初始数据，我们进行了（1）使用数据，（2）使用机器学习设计突变体库，以及（3）通过实验制备突变体并评估催化反应。添加了获得的实验数据，并重复三次循环（1） - （3）。结果，我们实现了一种突变体的构建，该突变体的催化旋转速度比RBM3*高四倍。上述一些研究结果是在国内学术会议上提出的，并受到了高度赞扬。

项目成果

C-H Bond Amination Catalyzed by Engineered Hemoprotein Containing Iron Porphycene as an Artificial Cofactor

含铁卟啉作为人工辅助因子的工程血红素蛋白催化 C-H 键胺化

• 发表时间: 2022
• 作者: Yoshiyuki Kagawa;Koji Oohora;Takashi Hayashi
• 通讯作者: Takashi Hayashi

再構成ミオグロビンによる分子内C-H結合アミノ化反応

使用重构肌红蛋白的分子内 C-H 键胺化反应

• 发表时间: 2021
• 作者: 香川佳之;大洞光司;林高史
• 通讯作者: 林高史

Ethylbenzene Oxidation by a Hybrid Catalysis System of Reconstituted Myoglobin and Silica-protected PdAu Nanoparticles under a Hydrogen-Oxygen Mixed Atmosphere.

氢氧混合气氛下重构肌红蛋白和二氧化硅保护的 PdAu 纳米颗粒的混合催化系统氧化乙苯。

• 发表时间: 2023
• 期刊: Journal of Porphyrins and Phthalocyanines
• 影响因子: 1.5
• 作者: Koji Oohora;Yoshiyuki Kagawa;Yasutaka Kuwahara;Hiromi Yamashita;Takashi Hayashi
• 通讯作者: Takashi Hayashi

鉄ポルフィセン含有ヘムタンパク質によるC-H結合アミノ化反応

含铁卟啉血红素蛋白的C-H键胺化反应

• 发表时间: 2022
• 作者: 香川佳之;大洞光司;林高史
• 通讯作者: 林高史

C-H Bond Amination Catalyzed by Reconstituted Myoglobin with Iron Porphycene

重构肌红蛋白与铁卟啉催化的 C-H 键胺化

• 发表时间: 2021
• 作者: Yoshiyuki Kagawa;Koji Oohora;Takashi Hayashi
• 通讯作者: Takashi Hayashi