細胞内で高難度反応の触媒として働く人工金属酵素の創製

创建人造金属酶作为细胞内困难反应的催化剂

基本信息

批准号：
22KJ2064
负责人：
香川佳之
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、位置・立体選択的なC-H結合官能基化反応を促進する人工金属酵素の開発と細胞内反応への応用をめざしている。当該年度は人工金属酵素のタンパク質構造に着目し、人工補因子である鉄ポルフィセン錯体と種々のヘムタンパク質やその変異体と複合化し、C-H結合アミノ化反応の活性評価を実施した。まず、鉄ポルフィセン錯体と各種ヘムタンパク質のアポ体を複合化し、分子内C-H結合アミノ化反応に対する触媒活性を評価した。触媒回転数はタンパク質構造により変化し、シトクロムP450BM3 (BM3)と鉄ポルフィセン錯体を複合化した再構成シトクロムP450BM3 (rBM3)が高い触媒回転数を示した。次に、変異導入によるrBM3のタンパク質構造を改変し、高活性化を実施した。具体的には、補因子に配位しているシステインに着目し、19種類の一重変異体について、触媒反応を評価した。その結果、アスパラギン酸に置換した再構成体の変異体(rBM3*)が、rBM3に対して2倍高い触媒回転数を示した。次に、rBM3*の基質結合部位に存在する5つのアミノ酸残基に着目し、rBM3*一重変異体(95種類)とランダム変異導入により得られた多重変異体(約30種)を評価したところ、複数の変異体において、触媒回転数およびエナンチオ選択性が向上する結果を得た。さらに、より高活性な多重変異体の構築に向け、機械学習を使用した変異体の探索を実施した。得られた変異体データを初期データとし、(1)データを用いた機械学習モデルの構築、(2)機械学習による変異体ライブラリの設計、(3)実験による変異体の調製と触媒反応評価を実施した。得られる実験データを加えて、(1)-(3)のサイクルをさらに3回繰り返した。その結果、rBM3*に対して4倍高い触媒回転数を示す変異体の構築を達成した。上記の研究成果の一部は国内の学会にて発表し、高い評価を受けた。

在这项研究中，我们的目标是开发促进区域和立体选择性C-H键功能化反应的人工金属酶，并将其应用于细胞内反应。在本财年，我们重点研究了人工金属酶的蛋白质结构，并通过将人工辅助因子铁卟啉复合物与各种血红素蛋白及其突变体缀合来评估C-H键胺化反应的活性。首先，我们将铁卟吩配合物与各种血红素蛋白的 apo 形式络合，并评估其对分子内 C-H 键胺化反应的催化活性。催化转换率根据蛋白质结构而变化，并且由细胞色素P450BM3（BM3）和铁卟啉复合物复合而成的重组细胞色素P450BM3（rBM3）表现出高催化转换率。接下来，我们通过引入突变来修改rBM3的蛋白质结构以实现高激活。具体来说，我们关注与辅因子协调的半胱氨酸，并评估了 19 种单突变体的催化反应。结果，天冬氨酸被取代的重组突变体(rBM3*)显示出比rBM3高两倍的催化周转率。接下来，我们关注rBM3*底物结合位点中存在的5个氨基酸残基，并评估了rBM3*单突变体（95种）和通过随机诱变获得的多突变体（约30种），我们获得了催化的结果。几个突变体的周转率和对映选择性得到改善。此外，我们利用机器学习来寻找突变体，以构建多个具有更高活性的突变体。使用获得的突变体数据作为初始数据，我们进行了（1）使用该数据构建机器学习模型，（2）使用机器学习设计突变体库，以及（3）通过以下方法制备突变体并评估催化反应进行了实验。添加所获得的实验数据，将循环(1)-(3)再重复3次。结果，我们成功构建了一个突变体，其催化周转率是 rBM3* 的四倍。上述部分研究成果在国内学术会议上发表并获得好评。

项目成果

期刊论文数量（14）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

C-H Bond Amination Catalyzed by Engineered Hemoprotein Containing Iron Porphycene as an Artificial Cofactor

含铁卟啉作为人工辅助因子的工程血红素蛋白催化 C-H 键胺化

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Yoshiyuki Kagawa;Koji Oohora;Takashi Hayashi
通讯作者：
Takashi Hayashi

再構成ミオグロビンによる分子内C-H結合アミノ化反応

使用重构肌红蛋白的分子内 C-H 键胺化反应

DOI：
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
0
作者：
香川佳之;大洞光司;林高史
通讯作者：
林高史

Ethylbenzene Oxidation by a Hybrid Catalysis System of Reconstituted Myoglobin and Silica-protected PdAu Nanoparticles under a Hydrogen-Oxygen Mixed Atmosphere.

氢氧混合气氛下重构肌红蛋白和二氧化硅保护的 PdAu 纳米颗粒的混合催化系统氧化乙苯。

DOI：
发表时间：
2023
期刊：
Journal of Porphyrins and Phthalocyanines
影响因子：
1.5
作者：
Koji Oohora;Yoshiyuki Kagawa;Yasutaka Kuwahara;Hiromi Yamashita;Takashi Hayashi
通讯作者：
Takashi Hayashi

鉄ポルフィセン含有ヘムタンパク質によるC-H結合アミノ化反応

含铁卟啉血红素蛋白的C-H键胺化反应