造血幹細胞・リンパ球前駆細胞の増幅分化制御とその免疫監視機構再生への応用

造血干细胞和淋巴祖细胞扩增和分化的控制及其在免疫监视系统再生中的应用

基本信息

批准号：
16043213
负责人：
高木智
金额：
$ 3.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1)造血幹細胞・リンパ球前駆細胞の増幅を制御する分子機構の解明:Lnk欠損により機能的な骨髄造血幹細胞が著増すること、一部の造血幹細胞においては細胞あたりの造血系再構築能も亢進していることを個々の造血幹細胞の競合的骨髄再構築能を個別に検討することにより明らかにした。CD34陰性Kit陽性Sca-1陰性の造血幹細胞における遺伝子発現プロファイルの変化についてジーンチップによる検討を推進した。2)骨髄内における造血幹細胞のホーミング機構の解析:Lnkを過剰発現させた線維芽細胞株ではアクチン細胞骨格に変化が生じ、細胞分裂や細胞遊走が阻害されることを明らかにした。分化抗原陰性の造血前駆細胞を正常及びLnk欠損マウスより精製し異なる蛍光色素で標識して静注したところ、Lnk欠損前駆細胞の骨髄への分布が亢進している可能性が示唆された。3)造血幹細胞、リンパ球前駆細胞の分化増殖制御に向けての基礎技術開発:Lnk阻害法を開発し、免疫監視機構の再生能亢進への応用の基盤整備を目指した。種々のLnk変異体をc-Kit依存性に増殖する細胞株に発現させ機能ドメインを同定した。増殖抑制にはSH2ドメインが必須であり、SH2変異体はドミナントネガティブ(DN)変異体として機能することがわかった。SH2変異に加えてPHドメイン欠損とC末端領域欠損を組み合わせることで、より効果的なDn-Lnk変異体を作出した。得られたDN-Lnk変異体をレトロウィルスベクターによりマウス造血前駆細胞に感染導入し骨髄移植実験系で効果を検討した結果、DN-Lnk変異体を導入した前駆細胞の造血能亢進が観察された。さらに、DN-Lnk変異体のプラスミドDNAによる一過性発現によっても造血前駆細胞の生着能が亢進すること、非骨髄破壊的移植条件下でも免疫不全マウスの免疫監視機構を効率よく再建できることがわかった。

1）阐明控制造血干细胞和淋巴祖细胞扩增的分子机制：Lnk缺乏使功能性骨髓造血干细胞数量显着增加，部分造血干细胞还具有重建每细胞造血系统的能力这是通过单独检查单个造血干细胞的竞争性骨髓重建能力而揭示的。我们继续使用基因芯片研究 CD34 阴性、Kit 阳性、Sca-1 阴性造血干细胞中基因表达谱的变化。 2）造血干细胞在骨髓中的归巢机制分析：我们发现在过表达Lnk的成纤维细胞系中，肌动蛋白细胞骨架发生变化，抑制细胞分裂和迁移。当从正常和Lnk缺陷小鼠中纯化分化抗原阴性造血祖细胞，用不同荧光染料标记并静脉注射时，表明Lnk缺陷祖细胞向骨髓的分布可能会增强。 3）控制造血干细胞和淋巴祖细胞分化和增殖的基础技术开发：我们开发了Lnk抑制方法，旨在为应用免疫监视机制增强再生能力奠定基础。我们在以 c-Kit 依赖性方式增殖的细胞系中表达了各种 Lnk 突变体，并鉴定了它们的功能域。研究发现，SH2 结构域对于生长抑制至关重要，SH2 突变体起到显性失活 (DN) 突变体的作用。通过将 SH2 突变与 PH 结构域缺失和 C 末端区域缺失相结合，我们创建了更有效的 Dn-Lnk 突变体。使用逆转录病毒载体将获得的DN-Lnk突变体导入小鼠造血祖细胞，并在骨髓移植实验系统中检查其效果，结果观察到导入了DN-Lnk突变体的祖细胞的造血能力得到了增强。此外，研究表明，使用质粒DNA瞬时表达DN-Lnk突变体可以增强造血祖细胞的植入能力，并且即使在非清髓性移植条件下也可以有效地重建免疫缺陷小鼠的免疫监视机制。