レプリコンを用いたC型肝炎ウイルス・宿主間相互作用の分子機序に関する研究

利用复制子研究丙型肝炎病毒与宿主相互作用的分子机制

基本信息

批准号：
16017262
负责人：
堀田博
金额：
$ 6.02万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

1.NS3とp53の相互作用の解析:臨床分離株から得られた種々のアミノ酸配列を有するNS3を単独で培養細胞に発現させた場合、その細胞内局在は3通りパターン(斑点状、びまん性および混合型)に分けられた。そして、斑点状局在を示すNS3は、びまん性のものに比べて、p53とより効率よく会合し、p53機能をより強く阻害した。これらのNS3の性状は1〜数カ所のアミノ酸点変異により変化した。なかでも、NS3の106位のLeuをAlaに置換した場合にp53との会合が最も顕著に抑制された。さらに、NS3とp53の会合はHCVレプリコン(サブゲノムおよび全長ゲノム)においても見られ、p53機能がHCVレプリコン複製細胞で減弱していた。2.NS5AとSykの相互作用の解析:個々のHCV蛋白とSykを培養細胞に共発現させた場合、NS5Aのみが効率よくSykと会合し、その会合にはNS5AのN末端180残基とSykのSH2ドメインが必要であった。NS5AとSykの会合により、Sykのチロシンキナーゼ活性が阻害され、さらにSykの下流に位置するPLC-γ1の活性化も阻害された。Sykキナーゼ活性の阻害には、会合に必要なNS5AのN末端180残基のみならず、同時にISDRやPKR結合ドメインを含むキナーゼ活性制御領域が必要であった。また、HCVレプリコン(サブゲノムおよび全長ゲノム)複製細胞においても、NS5AとSykが会合することを証明した。以上の結果より、NS3の細胞内局在やp53との相互作用、及びNS5AとSykの相互作用の程度はHCVの臨床分離株間で異なっており、発癌作用を含むウイルス病原性も異なる可能性が示唆された。

1. NS3与p53相互作用的分析：当从临床分离株获得的具有多种氨基酸序列的NS3在培养细胞中单独表达时，其细胞内定位以三种模式发生（斑点型、弥漫型和混合型）。此外，NS3 表现出与 p53 更有效相关的斑块定位，并且比弥散定位更强烈地抑制 p53 功能。 NS3 的这些特性因一到几个氨基酸点突变而改变。其中，当NS3的106位Leu被Ala取代时，与p53的关联被最显着地抑制。此外，在HCV复制子（亚基因组和全长基因组）中也观察到NS3和p53的关联，并且p53功能在HCV复制子复制细胞中减弱。 2. NS5A和Syk之间的相互作用分析：当单个HCV蛋白和Syk在培养细胞中共表达时，只有NS5A能够与Syk有效结合，并且这种结合需要涉及NS5A和Syk结构域的N端180个残基。 NS5A与Syk的结合抑制了Syk的酪氨酸激酶活性，并且还抑制了位于Syk下游的PLC-γ1的激活。 Syk 激酶活性的抑制不仅需要关联所需的 NS5A N 端 180 个残基，还需要包含 ISDR 和 PKR 结合域的激酶活性控制区。我们还证明 NS5A 和 Syk 在 HCV 复制子（亚基因组和全长基因组）复制细胞中相关。从上述结果来看，HCV临床分离株之间NS3的细胞内定位、与p53的相互作用以及NS5A和Syk之间的相互作用程度不同，并且病毒的致病性，包括致癌作用，也可能不同。