レプリコンを用いたC型肝炎ウイルス・宿主間相互作用の分子機序に関する研究

利用复制子研究丙型肝炎病毒与宿主相互作用的分子机制

基本信息

批准号：
15019063
负责人：
堀田博
金额：
$ 3.14万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

親株(Con1株)C型肝炎ウイルス(HCV)サブジェノミックレプリコンをもとに、リバースジェネティクスにより、NS5Aの種々の変異を持つHCVレプリコンを作製し、Huh-7細胞に導入してレプリコン複製細胞株を得た。導入した変異は第37位アミノ酸Phe->Leu変異(F37L)、Phe->Asn変異(F37N)、その他種々のISDR点突然変異等である。まず、F37Nを有するHCVレプリコン複製細胞株は全く得られず、F37NはHCV遺伝子複製にとって致死的変異であることがわかった。種々のNS5Aと2'-5'オリゴアデニル酸合成酵素(2-5AS)を発現する細胞における両蛋白の結合実験より、F37N変異NS5Aは2-5ASとの結合が弱いこと、また、脳心筋炎ウイルスのレスキュー実験より、F37N変異NS5Aはインターフェロン(IFN)抗ウイルス作用の抑制活性が弱いことを明らかにした。一方、F37L変異NS5Aは2-5ASとの結合が増加し、より強いIFN抑制作用を示した。F37L変異HCVレプリコンのIFN抑制作用は親株レプリコンと同程度であった。ISDR変異については、IFN応答性に関する臨床成績から重要と考えられる種々の点突然変異(T244A, I255V, D248G,3点〜8点変異など)を導入したHCVレプリコンを作製した。それらの変異レプリコンは親株と同程度によく複製した。これらのISDR点突然変異のうち、8点変異を除いて、IFN抗ウイルス効果の抑制は親株と同程度であった。現在、8点変異及び他の部位のISDR変異を有するレプリコンを作製し、IFN抗ウイルス効果に及ぼす影響についてさらに詳細に解析を進めている。さらに、Akt/Protein kinase B(PKB)に及ぼすHCV全蛋白の影響を調べる目的で、全長HCV遺伝子発現レプリコン複製細胞を作製している。Akt/PKB酵素活性の測定法を確立し、コア蛋白がPDGFによるArt/PKBの活性化を増強することを明らかにした。今後、全長HCVレプリコン複製細胞株における。Akt/PKB活性について詳細に検討する予定である。

基于亲本株（Con1株）丙型肝炎病毒（HCV）亚基因组复制子，通过反向遗传学产生具有各种NS5A突变的HCV复制子，并将其导入Huh-7细胞中以产生复制子复制细胞。引入的突变包括第37个氨基酸Phe->Leu突变(F37L)、Phe->Asn突变(F37N)以及各种其他ISDR点突变。首先，没有获得含有F37N的HCV复制子复制细胞系，表明F37N是HCV基因复制的致死突变。在表达各种 NS5A 和 2'-5' 寡腺苷酸合酶 (2-5AS) 的细胞中进行两种蛋白的结合实验表明，F37N 突变体 NS5A 与 2-5AS 的结合较弱，并且与脑心肌炎相关。突变型 NS5A 对干扰素 (IFN) 抗病毒作用具有弱抑制活性。另一方面，F37L突变体NS5A与2-5AS的结合增加，并表现出更强的IFN抑制作用。 F37L突变型HCV复制子的IFN抑制效果与亲本株复制子相当。关于ISDR突变，我们制作了HCV复制子，其中引入了根据IFN反应性的临床结果认为重要的各种点突变（T244A、I255V、D248G、3至8点突变等）。这些突变复制子和亲本菌株一样进行复制。在这些ISDR点突变中，除了8个点突变外，IFN抗病毒效果的抑制与亲本株相当。我们目前正在构建具有八个点突变和其他位点ISDR突变的复制子，并正在对其对IFN抗病毒功效的影响进行更详细的分析。此外，为了研究整个 HCV 蛋白对 Akt/蛋白激酶 B (PKB) 的影响，我们正在生成表达全长 HCV 基因的复制子复制细胞。我们建立了一种测量 Akt/PKB 酶活性的方法，并揭示了核心蛋白增强了 PDGF 对 Art/PKB 的激活。未来，全长HCV复制子将在细胞系中复制。我们计划详细检查 Akt/PKB 活动。