生殖腺細胞の遺伝子発現に与えるダイオキシンの影響についての研究

二恶英对性腺细胞基因表达影响的研究

基本信息

批准号：
14042270
负责人：
川尻要
金额：
$ 2.69万
依托单位：
Research Institute for Clinical Oncology, Saitama Cancer Center
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

1).分子内修飾と細胞密度によるAhRの細胞内局在の調節機構i)AhRはHaCaTの細胞密度により細胞内局在が変化し、低密度では主に核に高密度では細胞質に局在する。核外輸送阻害剤であるLeptomycin Bの添加実験より、密度依存的な分布の変化は高密度におけるAhRの核外輸送の促進によることが示唆された。(ii)細胞密度によりAhRの転写活性は変化し、その局在性に依拠することをXRE-luciferaseを組み込んだHaCaT細胞のレポーター活性で明らかにした。(iii)XRE-GFPを組み込ませたHaCaT細胞を用いてin vitro wound healing modelによる実験を行った結果、転写活性化が細胞間接着の希薄なwound edgesにそって見られることを明らかにした。(iv)AhRの核外輸送活性はNESのSer68をnegative chargeをもつAspに置換すると阻害される。この観察はSer68がリン酸化されるとAhRは核内に蓄積することを示唆する。(v)Phosphoserine68を含むペプチド抗体[Anti-AhR(61-74)-pS68]を作製し、活性化AhRが核内でリン酸化されることを明らかにした。(vi)p38MAPKの阻害剤SB203580でAhRの局在はより細胞質に移るが、ERK-MAPK系であるMEKの阻害剤U0126では変化が見られなかった。また、phosphatase阻害剤であるオカダ酸では逆に核への蓄積が促進された。従って、p38MAPKによるNES中のSer68のリン酸化と、細胞間接着シグナルで調節されるその脱リン酸化が細胞密度によるAhRの局在変化の分子機構として考えられる。2).生殖腺細胞でのAhR/ARNTの機能解析His-AhRを恒常的に発現している細胞は細胞増殖が遅く、またリガンドであるMC添加によりさらにその増殖速度が低下することが観察された。EGFR mRNAの発現量の変化は見られなかったが、EGFRタンパクのリガンド依存的な分解が観察された。この分解においてはProteasome阻害剤であるMG-132の添加効果は見られなかった。

1）通过分子内修饰和细胞密度调节AhR亚细胞定位i）AhR的亚细胞定位根据HaCaT的细胞密度而变化，在低密度时，它主要定位在细胞核中，在高密度时，它主要定位在细胞核中。细胞质做。添加核输出抑制剂瘦霉素 B 的实验表明，密度依赖性分布变化是由于在高密度下促进了 AhR 核输出。 (ii) AhR 的转录活性根据细胞密度而变化，并取决于其定位，正如掺有 XRE 荧光素酶的 HaCaT 细胞的报告活性所揭示的那样。 (iii) 使用掺有 XRE-GFP 的 HaCaT 细胞进行体外伤口愈合模型的实验表明，沿着细胞间粘附力较弱的伤口边缘观察到转录激活。 (iv) 通过用带负电的天冬氨酸取代 NES 的 Ser68 来抑制 AhR 的核输出活性。这一观察结果表明，当 Ser68 磷酸化时，AhR 在细胞核中积聚。 (v) 我们创建了含有磷酸丝氨酸68的肽抗体[Anti-AhR(61-74)-pS68]，并证明激活的AhR在细胞核中被磷酸化。 (vi) p38MAPK 抑制剂 SB203580 将 AhR 定位转移至细胞质，但 MEK（ERK-MAPK 系统）抑制剂 U0126 未观察到变化。另一方面，磷酸酶抑制剂冈田酸促进细胞核中的积累。因此，p38MAPK 对 NES 中 Ser68 的磷酸化及其受细胞间粘附信号调节的去磷酸化被认为是根据细胞密度改变 AhR 定位的分子机制。 2).AhR/ARNT在性腺细胞中的功能分析观察到组成型表达His-AhR的细胞增殖缓慢，并且通过添加配体MC进一步降低增殖率。尽管没有观察到 EGFR mRNA 表达水平的变化，但观察到 EGFR 蛋白的配体依赖性降解。没有观察到蛋白酶体抑制剂 MG-132 对这种降解的影响。