真核細胞ゲノム上の複製ドメイン・レプリコンの複製機序の解明

阐明真核基因组复制域和复制子的复制机制

• 批准号: 11239204
• 负责人: 奥村 克純
• 金额: $ 30.85万
• 依托单位: Mie University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11239204/
• 关键词: DNA複製; 複製フォーク; DNAファイバー; チェックポイント; 核マトリックス; 分子コーミング; インプリンティング; 複製ファクトリー; レプリコン; 動物細胞; ゲノム; FISH; 転写装置; 核マトリクス; 出芽酵母; 染色体バンド構造; 動物細胞ゲノム; DNA replication; genome structure; DNA fiber; heterochromatin

(1)ヒトおよびマウスの培養細胞を用いて、細胞周期S期の進行に伴う複製の進行過程を、S期における複製タイミングと複製部位の核内配置、染色体バンド構造、さらに複製フォークの進行速度について解析し、これらが密接に関連することを明らかにした。特に、複製フォークの進行速度がS期の初期から中期にかけて一端減速し、後期に最も速くなることを、独自に開発したDNAファイバー上で複製フォークの進行速度を測定する方法により明らかにした。すなわち、染色体上でS期初期に複製するRバンド領域からS期後期に複製するGバンド領域の境界のR/G遷移領域、およびマウス細胞のセントロメアヘテロクロマチン周辺領域の複製フォークの進行速度か最も遅くなることを見出した。また、マウス・セントロメアヘテロクロマチン周辺領域の複製起点の活性化と複製フォークの進行速度はヒストンのアセチル化により制御されていることを明らかにした。さらに、カンプトテシン(CPT)処理によるDNA損傷時に作動するチェックポイント制御についても検討し、各種特異的阻害剤存在下での複製フォーク速度やDNA合成量を調べる実験から、DNA損傷時に、S期チェックポイント因子PI3KKが複製開始点の抑制と複製フォークの安定性に貢献することを見出した。(2)複製・転写等の核内イベントへの核マトリックスの関与を明らかにするため、転写誘導される熱ショックタンパク質HSP70遺伝子領域の核マトリックスとの結合状態について転写ファクトリーを含めたモデルを提示すると共に、転写されないゲノム領域が、複製前に核マトリックスに結合し、複製後に直ちに離れることを明らかにした。(3)分子コーミング技術を確立し、DNAファイバー上での複製解析へ応用する一方、インプリント遺伝子の複製がアリル間で非同調的なタイミングで複製することを独自の方法で証明した。

（1）使用人和小鼠培养的细胞，我们分析了复制进程过程，随着细胞周期S相的进行，在S相中的复制时间进行，复制位点的核排列，染色体带结构和复制叉的进展速率，并揭示了这些相关的相关性。特别是，我们揭示了复制叉的进展速率从季节早期到中期S阶段降低了一步，而在后期阶段的速率最快的速率则使用了一种测量在独特开发的DNA纤维上复制叉的进展速率的方法。换句话说，我们发现，在染色体上复制的G波段区域边界的R/G转变区域在S阶段复制到R/G转型区域，复制叉进展速率或围绕小鼠细胞中心粒异质素的区域中的复制叉进度或最慢。我们还揭示了小鼠中心异染色质区域复制起源的激活，复制叉的进展速率受组蛋白乙酰化控制。 Furthermore, we investigated the checkpoint control that activates during DNA damage by camptothecin (CPT) treatment, and from experiments examining the replication fork velocity and amount of DNA synthesis in the presence of various specific inhibitors, we found that the S-phase checkpoint factor PI3KK contributes to the suppression of the replication origin and stability of the replication fork during DNA damage. （2）为了阐明核基质参与核事件（例如复制和转录），我们提出了一个模型，其中包括用于使用核基质转录的HSP70基因区域的转录厂，我们还揭示了非译者基因组基因组区域在复制之前与核基质结合，并在复制之前与核基质结合。 （3）我们已经建立了分子梳理技术，并将其应用于DNA纤维的复制分析，并以独特的方式证明了在等位基因之间不对称的时候重复基因复制。

项目成果

Masaki Ishida: "DNA Fluorescence In Situ Hybridization in Paramecium : Telomere Localization in Macronucleus"Zoological Science. 17巻. 1289-1295 (2000)

Masaki Ishida：“草履虫 DNA 荧光原位杂交：大核中的端粒定位”《动物学科学》，第 17 卷，1289-1295（2000 年）。

奥村 克純: "クロマチン構造とDNA複製"生体の科学. 54巻3号. 185-191 (2003)

Katsumi Okumura：“染色质结构和 DNA 复制”《生物科学》第 54 卷，第 3. 185-191 期（2003 年）。

Teijiro Aso: "Structural Organization and Chromosome Location of the Mouse Elongin A Gene(Tceb3)"Cytogenetics Cell Genetics. 86巻3-4号. 259-262 (1999)

Teijiro Aso：“小鼠 Elongin A 基因 (Tceb3) 的结构组织和染色体位置”《细胞遗传学》第 86 卷，第 259-262 期（1999 年）。

Naoyuki Fujita: "Methylation-mediated Transcriptional Silencing in Euchromatin by Methyl-CpG Binding Protein MBD1 Isoforms"Molecular and Cellular Biology. 19巻9号. 6415-6426 (1999)

Naoyuki Fujita：“甲基化介导的常染色质转录沉默”，《分子与细胞生物学》，第 19 卷，第 6415-6426 期（1999 年）。

Tatsuya Hayashi: "Organization and Chromosomal Localization of the Human Endothelial Protein C Receptor Gene"Gene. 238巻2号. 367-373 (1999)

Tatsuya Hayashi：“人内皮蛋白 C 受体基因的组织和染色体定位”基因，第 238 卷，第 2 期，367-373 (1999)