FISHによるマルチレプリコンの複製開始制御機構解析法の確立

FISH分析多复制子复制起始控制机制的方法建立

• 批准号: 10162205
• 负责人: 奥村 克純
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: Mie University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10162205/
• 关键词: FISH; Replicon; DNA fiber; Bromodeoxyuridine; Histone acetylation; DNA replication

本研究では、真核性染色体のもつ特徴であるマルチレプリコンの複製開始制御機構を明らかにするための新しい解析技術を、蛍光in situ hybridization(FISH)法を駆使して確立することを目指し、以下のように展開した。DNAファイバー上でのBrdU検出とFISHを併用することにより、数kbの解像度をもつ複製の進行過程を数百kbの範囲で個々の細胞で視覚的に追跡できるファイバーFISHによるレプリコン解析法の開発を行った。本年度は、基本的方法ではファイバーの検出時にDNAの一部の脱落が起こり、安定したシグナル検出ができない点を踏まえ、まず、本法の技術的基盤を見直した。ファイバー検出時のDNAの変性方法が原因であると考え、その条件を種々検討した結果、アルカリ条件下で変性させることによって、これまでの方法ではドットのつながりとして検出されたBrdUの取り込みを、分断の少ないライン状シグナルとして検出することに成功した。また、この変性条件下で検出したDNAのFISHシグナルもライン状に検出できた。BrdUとFISHの両者の同時検出にも成功したが、BrdUの検出感度の若干の低下が認められ、この点については、さらなる検討を要する。また、生細胞核内複製fociのクロモソームテリトリー内での配置を解析するため、蛍光標識ヌクレオチドを動物細胞に直接取り込ませる方法を導入して複製fociを生細胞のまま三次元イメージングし、これを固定して、FISHを行い、用いている固定法が複製fociレベルでは問題ないことを明らかにした。また、ゲノムクローンを用いるRNA-FISHによって核内RNA一次転写産物を検出し、非同調的複製をするDiGeorge Syndrome(DGS)責任領域のクローンがbiallelicに発現していることを明らかにした。また、セントロメアへテロクロマチン領域の低アセチル化状態の維持機構として、別の場所で脱アセチル化されたヒストンが、セントロメア領域に輸送されるという機構の存在を示した。

In this study, we aimed to establish a new analysis technique to clarify the mechanism of replication initiation control of multireplicons, a characteristic of eukaryotic chromosomes, using the fluorescence in situ hybridization (FISH) method, as follows: By using BrdU detection on DNA fibers and FISH, we developed a replicon analysis method using fiber FISH, which allows visual tracking of replication progression with a resolution of several kb in几百kb范围内的单个细胞。今年，我们首先审查了该方法的技术基础，考虑到检测到纤维时DNA的一部分丢失，并且无法进行稳定的信号检测。考虑到纤维检测过程中的DNA变性方法是原因，我们研究了各种条件，发现通过在碱性条件下定位它，我们成功地检测到了BRDU的掺入，BRDU的掺入是在以前的方法中被检测到的DOT连接，是线性的信号，几乎没有分裂。 Furthermore, the FISH signal of the DNA detected under these denaturing conditions was also detected in a line shape.尽管BRDU和FISH均同时成功检测到BRDU和FISH，但BRDU的检测灵敏度略有下降，这需要进一步考虑。此外，为了分析焦点在活细胞核中的位置，引入了一种方法，其中将荧光标记的核苷酸直接纳入动物细胞中，并在三维细胞中成像，而在三维细胞上进行了复制，而固定和鱼类使用的固定方法并不是在重复范围的固定方法中进行的。此外，使用基因组克隆通过RNA鱼检测到核RNA中的主要RNA转录本，表明在造成非同步的digeorge综合征（DGS）区域中的克隆以生物素质表达。它还证明了一种机制的存在，在该机制中，将脱乙酰化组蛋白在其他地方传输到丝粒异染色质区域，以此作为维持丝粒异染色质区域的低乙酰化态的机制。

项目成果

Sachiko Kitanaka: "Inactivating Mutations in the 25-Hydroxyvitamin D3 1α-Hydroxylase gene in Patients with Pseudovitamin D-Deficiency Rickets" New England Journal of Medicine. 338巻. 653-661 (1998)

Sachiko Kitanaka：“假性维生素 D 缺乏性佝偻病患者 25-羟基维生素 D3 1α-羟化酶基因的失活突变”《新英格兰医学杂志》338. 653-661 (1998)。

Katsuzumi Okumura: "Chromosomal Localization of Human DNA-binding Nuclear Protein(NP220)to 2P13.1-p13.2 by Fluorescence in situ Hybridization" Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. 62巻. 1640-1642 (1998)

Katsuzumi Okumura：“通过荧光原位杂交将人类 DNA 结合核蛋白 (NP220) 染色体定位到 2P13.1-p13.2”《生物科学、生物技术和生物化学》62。1640-1642 (1998)。

Yasushi Taniguchi: "Nucleotide Sequence of the Ring3 Gene in the Class II Region of the Mouse MHC and Its Abundant Expression in Testicular Germ Cells" Genomics. 51巻. 114-123 (1998)

Yasushi Taniguchi：“小鼠 MHC II 类区域中 Ring3 基因的核苷酸序列及其在睾丸生殖细胞中的丰富表达”基因组学 51. 114-123 (1998)。

Shin Ogata: "Effects of Poly(ADP-ribose)polymerase Inhibitors and NAD on the Apoptosis Induced by Actinomycin D in Human Leukemia Cells HL-60" Bulletin of the Faculty of Bioresources Mie University. (印刷中).

Shin Ogata：“聚（ADP-核糖）聚合酶抑制剂和 NAD 对放线菌素 D 诱导的人白血病细胞 HL-60 细胞凋亡的影响”三重大学生物资源学院通报（正在出版）。

Masato Tsurudome: "Primary Structure of the Light Chain of FRP-1/CD98/4F2 Predicts a Protein with 11 Transmembrane Domains" Journal of Immunology. (印刷中).

Masato Tsurudome：“FRP-1/CD98/4F2 轻链的一级结构预测具有 11 个跨膜结构域的蛋白质”《免疫学杂志》（正在出版）。