動物ゲノムのレプリコン構造解明のためのDNA複製部位可視化法の開発

开发用于阐明动物基因组复制子结构的 DNA 复制位点可视化方法

• 批准号: 13878121
• 负责人: 奥村 克純
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Mie University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13878121/
• 关键词: DNA複製; 染色体バンド構造; レプリコン; DNAファイバー; 蛍光標識; FISH

生きている動物細胞に蛍光標識ヌクレオチドを取り込ませ、複製中のDNAをラベルすることで、実際に複製が起こっているDNA領域を視覚的に検出できる技術を確立した。これを用いて、染色体DNAが間期核内でどのような順序、空間的配置で複製されるのかを詳細に解析した。その結果、細抱周期のS期が進むにつれて複製部位が核の内部から外部へと徐々に移動し、それが分裂期染色体のR/Gバンド構造と密接に関連していることを明らかにした。このことから、染色体DNAが一見無秩序に詰め込まれているような間期核内でも、それらは高度に組織化され、DNA複製制御と密接に関わっていると推定した。また、この方法で複製ラベルしたDNAを細胞核からファイバー状に引きのばし、より高解像度でDNA複製を解析できる技術を確立した。これにより、数千〜数十万塩基対の間隔でゲノム上に存在する複製開始領域を明確に検出することに成功した。これを用いて、細胞周期を同調した培養細胞でS期の最も初期に活性化される染色体複製ドメインを詳細に解析した結果、一つの複製ドメインを構成する複数のレプリコンのうち、最初に活性化されるレプリコンと、最初に活性化されたものに影響を受けて少し遅れて活性化されるレプリコンの二種類が存在することを明らかにした。また、細胞周期ごとに異なる標識を用いて複製ドメインを検出することで、複製ドメイン及び個々のレプリコンの利用(活性化)頻度を調べた結果、特定の複製ドメインはどの細胞周期でも安定に活性化される傾向にあったが、複製開始部位はそれほど厳密に決定されていないことを明らかにした。さらにFISH法と組み合わることにより特定のゲノム領域の解析ができるかを検討したところ、数十万塩基対にわたるマウスメジャーサテライト反復配列のみならず、1コピーしかないロドプシン遺伝子領域においても複製ドメインの構造を解析することに成功した。

已经建立了一项技术，可以通过将荧光标记的核苷酸标记为活动物细胞并标记为正在复制的DNA来视觉检测到复制的DNA区域。这被用来详细分析在相间核内复制的染色体DNA的顺序和空间排列。结果，我们透露，随着结合循环的S相进行，复制位点逐渐从核内部迁移到外部，这与有丝分裂染色体的R/G带结构密切相关。这表明，即使在染色体DNA似乎被无序的相间核中，它们也是高度组织的，并且与DNA复制控制密切相关。此外，已经建立了一项技术，该技术允许将DNA复制并用该方法标记为从细胞核中扩展到类似纤维的形状，并允许以更高的分辨率分析DNA复制。这导致成功检测了基因组上存在于基因组上的复制起始区域，该区域的间隔为数千至数十万个基对。使用此信息，我们已经详细分析了与细胞周期同步的培养细胞中最早的s阶段激活的染色体复制域，并揭示了构成单个复制域的多个复制子的染色体，有两种类型：有两种类型的类型：首先要激活复制子，并且首先会激活它们，以使其稍作激活，以稍作激活它们，并以首次激活它们，并稍作激活它们。此外，通过使用每个细胞周期的不同标签检测复制域，我们研究了复制域和单个复制子的使用频率（激活），并发现特定的复制域在任何细胞周期都倾向于稳定地激活，但是复制起始位点并未得到很好的确定。此外，当我们研究是否可以通过将特定的基因组区域与鱼类方法结合来​​分析特定的基因组区域时，我们成功地分析了复制结构域的结构，不仅在小鼠主要的卫星重复序列中，跨越了数十万个碱基对，而且在Rhopopsin基因区域中也只有一个副本。

项目成果

Morihiro Ito: "Up-regulated Expression of a Novel Gene in Activated Human Peripheral Blood Mononuclear Cells That is a Truncated Paralog of the Human System L Amino Acid Transporter 1"International Journal of Biochemistry and Cell Biology. (印刷中).

Morihiro Ito：“激活的人外周血单核细胞中新基因的表达上调，该基因是人类系统 L 氨基酸转运蛋白 1 的截短旁系同源物”《国际生物化学和细胞生物学杂志》（正在出版）。

Shin-ichiro Takebayashi: "5-Aza-2'-deoxycytidine Induces Histone Hyperacetylation of Mouse Centromeric Heterochromatin by a Mechanism Independent of DNA Demethylation"Biochemical Biophysical Research Communications. 288巻4号. 921-926 (2001)

Shin-ichiro Takebayashi：“5-Aza-2-脱氧胞苷通过独立于 DNA 去甲基化的机制诱导小鼠着丝粒异染色质的组蛋白过度乙酰化”《生化生物物理研究通讯》第 288 卷，第 4. 921-926 期（2001 年）。

Kazuhiro Kagotani: "Visualization of Transcription-dependent Association of Imprinted Genes with the Nuclear Matrix"Experimental Cell Research. (印刷中).

Kazuhiro Kagotani：“印记基因与核基质的转录依赖性关联的可视化”实验细胞研究（正在出版）。

Atsushi Kohda: "Preparation of Extended Metaphase Chromosomes from Human Cultured Cells Using a Topoisomerase II Inhibitor,ICRF-193"Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. 65巻5号. 1248-1251 (2001)

Atsushi Kohda：“使用拓扑异构酶 II 抑制剂 ICRF-193 从人类培养细胞中制备延伸的中期染色体”《生物科学》、《生物技术和生物化学》第 65 卷，第 5 期。1248-1251 (2001)

Koji Yamawaki: "Identification of Human CPI-17,an Inhibitory Phosphoprotein for Myosin Phosphatase"Biochemical Biophysical Research Communications. 285巻4号. 1040-1045 (2001)

Koji Yamawaki：“肌球蛋白磷酸酶抑制性磷蛋白人类 CPI-17 的鉴定”《生物化学生物物理研究通讯》，第 285 卷，第 4 期。1040-1045 (2001)