動物ゲノムのレプリコン構造解明のためのDNA複製部位可視化法の開発

开发用于阐明动物基因组复制子结构的 DNA 复制位点可视化方法

• 批准号: 13878121
• 负责人: 奥村 克純
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Mie University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13878121/
• 关键词: DNA複製; 染色体バンド構造; レプリコン; DNAファイバー; 蛍光標識; FISH

生きている動物細胞に蛍光標識ヌクレオチドを取り込ませ、複製中のDNAをラベルすることで、実際に複製が起こっているDNA領域を視覚的に検出できる技術を確立した。これを用いて、染色体DNAが間期核内でどのような順序、空間的配置で複製されるのかを詳細に解析した。その結果、細抱周期のS期が進むにつれて複製部位が核の内部から外部へと徐々に移動し、それが分裂期染色体のR/Gバンド構造と密接に関連していることを明らかにした。このことから、染色体DNAが一見無秩序に詰め込まれているような間期核内でも、それらは高度に組織化され、DNA複製制御と密接に関わっていると推定した。また、この方法で複製ラベルしたDNAを細胞核からファイバー状に引きのばし、より高解像度でDNA複製を解析できる技術を確立した。これにより、数千〜数十万塩基対の間隔でゲノム上に存在する複製開始領域を明確に検出することに成功した。これを用いて、細胞周期を同調した培養細胞でS期の最も初期に活性化される染色体複製ドメインを詳細に解析した結果、一つの複製ドメインを構成する複数のレプリコンのうち、最初に活性化されるレプリコンと、最初に活性化されたものに影響を受けて少し遅れて活性化されるレプリコンの二種類が存在することを明らかにした。また、細胞周期ごとに異なる標識を用いて複製ドメインを検出することで、複製ドメイン及び個々のレプリコンの利用(活性化)頻度を調べた結果、特定の複製ドメインはどの細胞周期でも安定に活性化される傾向にあったが、複製開始部位はそれほど厳密に決定されていないことを明らかにした。さらにFISH法と組み合わることにより特定のゲノム領域の解析ができるかを検討したところ、数十万塩基対にわたるマウスメジャーサテライト反復配列のみならず、1コピーしかないロドプシン遺伝子領域においても複製ドメインの構造を解析することに成功した。

通过将荧光标记的核苷酸掺入活体动物细胞中并标记正在复制的 DNA，我们建立了一种技术，使我们能够直观地检测实际发生复制的 DNA 区域。利用这一点，我们详细分析了染色体 DNA 在间期核内复制的顺序和空间排列。结果我们发现，随着有丝分裂周期S期的进行，复制位点逐渐从细胞核内部向外部移动，这与有丝分裂染色体的R/G带结构密切相关。由此，我们推断，尽管染色体DNA看似随机地堆积在间期核中，但它是高度组织化的，并且密切参与DNA复制的控制。此外，我们还建立了一种技术，可以使用这种方法将DNA复制标记从细胞核中以纤维的形式伸出，从而可以对DNA复制进行更高分辨率的分析。结果，他们成功地清楚地检测到基因组上以数千至数十万个碱基对间隔存在的复制起始区域。利用这一点，我们对细胞周期同步培养细胞中S期最早激活的染色体复制结构域进行了详细分析，发现在组成一个复制结构域的多个复制子中，染色体复制结构域是首先激活的复制子有两种类型：首先激活的复制子和受第一个激活的复制子影响稍后激活的复制子。此外，通过检测每个细胞周期中使用不同标记的复制域，我们研究了复制域和单个复制子的使用（激活）频率，结果发现特定的复制域在任何细胞周期中都被稳定激活。 ，我们发现复制起始位点并不是那么严格确定的。此外，我们研究了是否可以结合FISH方法来分析特定的基因组区域，结果发现复制域的结构不仅限于跨越数十万个碱基对的小鼠主要卫星重复序列，还包括视紫红质基因区域只有一个拷贝，分析成功。

项目成果

Morihiro Ito: "Up-regulated Expression of a Novel Gene in Activated Human Peripheral Blood Mononuclear Cells That is a Truncated Paralog of the Human System L Amino Acid Transporter 1"International Journal of Biochemistry and Cell Biology. (印刷中).

Morihiro Ito：“激活的人外周血单核细胞中新基因的表达上调，该基因是人类系统 L 氨基酸转运蛋白 1 的截短旁系同源物”《国际生物化学和细胞生物学杂志》（正在出版）。

Shin-ichiro Takebayashi: "5-Aza-2'-deoxycytidine Induces Histone Hyperacetylation of Mouse Centromeric Heterochromatin by a Mechanism Independent of DNA Demethylation"Biochemical Biophysical Research Communications. 288巻4号. 921-926 (2001)

Shin-ichiro Takebayashi：“5-Aza-2-脱氧胞苷通过独立于 DNA 去甲基化的机制诱导小鼠着丝粒异染色质的组蛋白过度乙酰化”《生化生物物理研究通讯》第 288 卷，第 4. 921-926 期（2001 年）。

Atsushi Kohda: "Preparation of Extended Metaphase Chromosomes from Human Cultured Cells Using a Topoisomerase II Inhibitor,ICRF-193"Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. 65巻5号. 1248-1251 (2001)

Atsushi Kohda：“使用拓扑异构酶 II 抑制剂 ICRF-193 从人类培养细胞中制备延伸的中期染色体”《生物科学》、《生物技术和生物化学》第 65 卷，第 5 期。1248-1251 (2001)

Kazuhiro Kagotani: "Visualization of Transcription-dependent Association of Imprinted Genes with the Nuclear Matrix"Experimental Cell Research. (印刷中).

Kazuhiro Kagotani：“印记基因与核基质的转录依赖性关联的可视化”实验细胞研究（正在出版）。

Koji Yamawaki: "Identification of Human CPI-17,an Inhibitory Phosphoprotein for Myosin Phosphatase"Biochemical Biophysical Research Communications. 285巻4号. 1040-1045 (2001)

Koji Yamawaki：“肌球蛋白磷酸酶抑制性磷蛋白人类 CPI-17 的鉴定”《生物化学生物物理研究通讯》，第 285 卷，第 4 期。1040-1045 (2001)