DNAカーテン上の複製フォーク超複合体の一分子観察

DNA帘上复制叉超复合物的单分子观察

• 批准号: 22KJ1763
• 负责人: 寺川 まゆ
• 金额: $ 3.08万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1763/
• 关键词: DNA複製; 再構成; 一分子観察

DNA複製は生命にとって非常に重要なイベントの一つとして知られている。DNAが複製されるためには、最低でも約20種類におよぶタンパク質が各段階に応じて集まり、協同して働く必要があることが知られている。これまでに、分子生物学的な手法を用いて、数々のDNA複製関連タンパク質が同定され、その機能の一端が明らかにされてきた。しかし、これまでの分子生物学研究においては雑多な分子も多く含む細胞の抽出液が用いられてきたことから、DNA複製の詳細な分子メカニズムはあまりよく分かっていない。本研究では、再構成系の実験系を用いて、DNA複製反応を一分子観察することにより、生物物理学的視点でDNA複製反応を観察し、分子機構を明らかにしていこうとしている。昨年度は、DNA複製に最低限必要なタンパク質の精製を終え、また精製したタンパク質のDNAへの結合能やunwinding能を調べた。今年度は、DNAカーテンをつくる技術を身に着け、精製したタンパク質の一部を用いて、タンパク質のDNAへの結合を一分子観察することを目指した。まず、DNAカーテンの作成のために、スライドガラスへの表面加工方法や、スライドガラスへの電子線を用いたパターン描写テクニックを身に着けた。DNAカーテン法ではλDNAを用いるため、ファージの培養やλDNAの精製方法なども学んだ。精製したλDNAを組み立てたDNAカーテン用のチャンバーに添加し、DNAカーテンを作成することに成功した。そこに、精製したORC,Cdc6,MCM2-7,Cdt1を添加し、複製開始前複合体と呼ばれるDNA複製の初期段階に見られる複合体をDNAに結合したものを観察することができた。

DNA 复制被认为是生命中最重要的事件之一。众所周知，DNA 的复制需要至少约 20 种蛋白质在每个阶段聚集在一起并共同发挥作用。迄今为止，利用分子生物学技术已经鉴定出许多与DNA复制相关的蛋白质，并且阐明了它们的一些功能。然而，由于迄今为止的分子生物学研究使用的是含有许多杂种分子的细胞提取物，因此DNA复制的详细分子机制尚不清楚。在本研究中，我们将利用重建的实验系统来观察单个分子上的DNA复制反应，从而从生物物理学的角度观察它们并试图阐明其分子机制。去年，我们完成了 DNA 复制所需的最少量蛋白质的纯化，并研究了纯化蛋白质与 DNA 结合和解旋的能力。今年，我的目标是获得创建 DNA 帘幕的技术，并使用一部分纯化蛋白质来观察与 DNA 结合的单分子蛋白质。首先，为了制作DNA窗帘，我学习了如何处理载玻片表面以及如何使用电子束在载玻片上绘制图案。由于DNA帘法中使用了λDNA，因此我们还了解了噬菌体的培养和λDNA的纯化方法。他们通过将纯化的 λDNA 添加到组装好的 DNA 幕室中，成功创建了 DNA 幕。通过添加纯化的 ORC、Cdc6、MCM2-7 和 Cdt1，我们能够观察到一种称为预起始复合物的复合物，它出现在 DNA 复制的早期阶段，与 DNA 结合。

项目成果

Single molecule imaging of DNA unwinding by budding yeast MCM2-7

芽殖酵母 MCM2-7 解旋 DNA 的单分子成像

• 发表时间: 2022
• 作者: Terakawa MS;Terakawa T
• 通讯作者: Terakawa T