分子シャペロンとしてのSecAの機能

SecA 作为分子伴侣的功能

基本信息

批准号：
07253225
负责人：
森博幸
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07253225/
关键词：
膜透過 SecA 分泌型タンパク質

项目摘要

1)Sec因子に依存して膜透過される分泌型タンパク質proOmpAを材料として、分子内にループ構造を持つ変異人工タンパク質を系統的に作製した。ループ構造形成による膜透過の停止の様子をin vitro系で解析した結果、得られる中間体は、アミノ末端からループまでの距離に対応して段階的に変化するのではなく、ある一定の間隔で不連続的に変化することが明らかとなった。このことは、前駆体タンパク質の膜透過が、約30アミノ酸残基単位でステップワイズに進行していることを示唆している。更に、前述の変異分泌型タンパク質のin vitro膜透過実験を、精製Sec因子を組み込んだ再構成膜を用いて行ったところ、膜透過活性発現に不可欠な3つの因子(SecA,E,Y)のみでこのステップワイズなパターンが再現出来ることを見いだした。また、他の実験より、SecAは分泌型タンパク質シグナルペプチド内の疎水領域を認識し得ることも明らかにした。これらの知見は、分泌型タンパク質は、SecAにより認識され、この因子のダイナミックな動きと連動してステップワイズに膜透過が進行している可能性を示している。2)SecAは、大腸菌膜透過反応に不可欠なATPaseである。この因子のATP加水分解の触媒残基の同定を目的として、他のATPaseとの一次構造比較から触媒残基と予想される133番目のAspをAsnに改変した変異型SecA(D133N)を作製、その酵素化学的解析、in vitro膜透過実験を行った。D133Nは、膜透過反応と共役したATPase活性が著しく低下していると同時に膜透過活性を完全に失っていたが、ATPの結合能力に変化は見られなかった。一方、SesAと相互作用する各因子に対する親和性は野生型と同程度であった。以上のことより、133番目のAsp残基が、膜透過と共役したATP加水分解の触媒残基として機能していることが明らかとなった。

1）使用分泌的蛋白质Proompa，该蛋白质可被膜渗透，具体取决于SEC因子，系统地生产了带有环结构的突变人造蛋白。由于循环结构的形成，对膜渗透的停止的体外分析表明，所获得的中间变化不连续，而不是从氨基终端到环的距离逐步改变逐步变化。这表明前体蛋白的膜渗透在大约30个氨基酸残基下逐步发展。此外，使用结合纯化的SEC因子的重构膜进行了突变分泌蛋白的体外膜通透性实验，我们发现该逐步模式只能用三个因素（SECA，E，Y）复制，这些因素（SECA，E，Y）对于表达膜耐受性活性的表达至关重要。其他实验还表明，SECA可以识别分泌的蛋白质信号肽中的疏水区。这些发现表明，分泌的蛋白质可以通过SECA识别，并且与该因素的动态运动结合使用了逐步膜渗透的进展。 2）SECA是大肠杆菌膜渗透反应必不可少的ATPase。为了鉴定该因子ATP水解的催化残基，我们准备了一个突变的SECA（D133N），该突变体从133rd ASP中修改为ASN，该ASP从133rd ASP（预计是催化残基），是根据与其他ATPases进行的催化残基的，并进行了综合化学分析和杀伤性膜片渗透性实验。 D133N与膜渗透反应和膜渗透活性完全丧失的ATPase活性显着降低，但观察到ATP的结合能力没有变化。另一方面，与SESA相互作用的每个因素的亲和力类似于野生类型。从上面可以揭示出位置133处的ASP残基作为与膜渗透结合的ATP水解的催化残基。