SecYEGチャンネルによる膜透過活性発現機構のアミノ酸残基レベルでの解析

氨基酸残基水平分析SecYEG通道跨膜活性表达机制

基本信息

批准号：
12780535
负责人：
森博幸
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12780535/
关键词：
SecY SecG SecA SecE protein translocation channel reconstitution ATPase

项目摘要

大腸菌における前駆体タンパク質の細胞質からペリプラズム空間への膜透過には、SecYEG膜透過チャンネルと、膜透過の駆動力を供給するSecA ATPaseが中心的な役割を担っている。我々は、種々のSecY変異体を用いたin vivo, in vitro解析より、SecA ATPase活性は、SecYの細胞質領域C5, C6との相互作用を介して厳密に制御されていることを示した。更にC5領域の徹底的な変異解析から、SecYの機能発現に必須のアミノ酸残基R357を同定した(Mori and Ito,(2001)PNAS(2001)98, 5128)。本年度は、C6領域の重要性をアミノ酸残基レベルで検討する為に、SecYのC末端領域を順次欠失させた変異体を系統的に作製し、C末から6番目のLeu残基の重要性を明らかにした(Chiba et al.,(2001)J. Bacteriol. in press)。SecYEG複合体は、基質タンパク質が膜透過するためのチャネルを形成していると考えられているが、その実体は不明なままである。SecY分子内のSecE, SecG相互作用部位の同定は、チャネル構造の分子レベルでの理解において重要である。Sec因子間の近接部位の同定を目指してSecY分子内にCys残基を1つだけ持つ変異体を系統的に作製し、システイン特異的な化学架橋剤と組み合わせることで、近接部位をアミノ酸残基レベルで検討した。その結果、SecYのC2, C3領域がSecGと近接している事を明らかにした。C3領域内の3ecY変異体が示す生育分泌阻害を特異的に相補するsecG変異体の分離にも成功した。これらの結果は、C2, C3領域がSecGとの相互作用領域である事を強く示唆している(Satoh et al., manuscript in preparation)。

SecYEG 跨膜通道和 SecA ATP 酶为膜渗透提供驱动力，在大肠杆菌中前体蛋白从细胞质到周质空间的膜渗透中发挥着核心作用。通过使用各种 SecY 突变体的体内和体外分析，我们发现 SecA ATPase 活性通过与 SecY 的细胞质区域 C5 和 C6 相互作用而受到严格调节。此外，通过对C5区的彻底突变分析，我们鉴定了氨基酸残基R357，其对于SecY的功能表达至关重要(Mori和Ito, (2001) PNAS (2001) 98, 5128)。今年，为了在氨基酸残基水平上检查C6区域的重要性，我们系统地创建了SecY的C末端区域被顺序删除的突变体，并且（Chiba et al., (2001) J. Bacteriol正在出版）。 SecYEG 复合物被认为形成底物蛋白穿过膜的通道，但其实际性质仍然未知。识别 SecY 分子内的 SecE 和 SecG 相互作用位点对于理解分子水平的通道结构非常重要。为了确定 Sec 因子之间的邻近位点，我们系统地创建了 SecY 分子中仅具有一个 Cys 残基的突变体，并通过将它们与半胱氨酸特异性化学交联剂结合，我们将邻近位点与所考虑的氨基酸残基连接起来。在水平上。结果表明，SecY 的 C2 和 C3 区域与 SecG 接近。我们还成功分离出一种 secG 突变体，该突变体特异性地补充了 C3 区域中 3ecY 突变体所表现出的生长和分泌抑制作用。这些结果强烈表明 C2 和 C3 区域是与 SecG 的相互作用区域（Satoh 等人，手稿正在准备中）。