SecYEGチャンネルによる膜透過活性発現機構のアミノ酸残基レベルでの解析

氨基酸残基水平分析SecYEG通道跨膜活性表达机制

基本信息

批准号：
12780535
负责人：
森博幸
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12780535/
关键词：
SecY SecG SecA SecE protein translocation channel reconstitution ATPase

项目摘要

大腸菌における前駆体タンパク質の細胞質からペリプラズム空間への膜透過には、SecYEG膜透過チャンネルと、膜透過の駆動力を供給するSecA ATPaseが中心的な役割を担っている。我々は、種々のSecY変異体を用いたin vivo, in vitro解析より、SecA ATPase活性は、SecYの細胞質領域C5, C6との相互作用を介して厳密に制御されていることを示した。更にC5領域の徹底的な変異解析から、SecYの機能発現に必須のアミノ酸残基R357を同定した(Mori and Ito,(2001)PNAS(2001)98, 5128)。本年度は、C6領域の重要性をアミノ酸残基レベルで検討する為に、SecYのC末端領域を順次欠失させた変異体を系統的に作製し、C末から6番目のLeu残基の重要性を明らかにした(Chiba et al.,(2001)J. Bacteriol. in press)。SecYEG複合体は、基質タンパク質が膜透過するためのチャネルを形成していると考えられているが、その実体は不明なままである。SecY分子内のSecE, SecG相互作用部位の同定は、チャネル構造の分子レベルでの理解において重要である。Sec因子間の近接部位の同定を目指してSecY分子内にCys残基を1つだけ持つ変異体を系統的に作製し、システイン特異的な化学架橋剤と組み合わせることで、近接部位をアミノ酸残基レベルで検討した。その結果、SecYのC2, C3領域がSecGと近接している事を明らかにした。C3領域内の3ecY変異体が示す生育分泌阻害を特異的に相補するsecG変異体の分離にも成功した。これらの結果は、C2, C3領域がSecGとの相互作用領域である事を強く示唆している(Satoh et al., manuscript in preparation)。

Secyeg膜渗透通道和为膜渗透的驱动力的Seca ATPase在埃斯切里希亚大肠杆菌中从细胞质到周质空间的前体蛋白渗透到膜渗透中起着核心作用。我们使用各种SECY突变体显示了体内和体外分析表明，SECA ATPase活性通过与Secy的细胞质区域C5和C6的相互作用严格调节。此外，对C5区域的彻底突变分析确定了氨基酸残基R357，这对于SECY的功能表达至关重要（Mori and Ito，（2001）PNAS（2001）PNAS（2001）98，5128）。在今年，为了检查C6区域在氨基酸残基水平上的重要性，其中依次删除了Secy的C末端区域的突变体，从而阐明了C-末端第六LEU残基的重要性（Chiba等人（Chiba et al。，（2001）J。Bacteriol。在Press中）。人们认为Secyeg复合物形成了底物蛋白渗透膜的通道，但其实体仍然未知。 SECY分子中SECE和SECG相互作用位点的鉴定对于理解分子水平的通道结构很重要。为了确定SEC因子之间的接近性，系统地创建了SECY分子中仅有一个Cys残基的突变体，并且通过将它们与半胱氨酸特异性的化学交联链结合在一起，在氨基酸残留水平上检查了接近位点。结果，据透露，Secy的C2和C3区域与SECG紧密相邻。我们还成功地分离了SECG突变体，这些突变体特异性地补充了C3区域3欧突变体引起的生长分泌。这些结果强烈表明C2和C3区域是与Secg相互作用的区域（Satoh等人，手稿中的手稿）。