高度好熱菌SecYEタンパク質膜透過チャンネルの構造生物学的解析

超嗜热SecYE蛋白膜通透性通道的结构生物学分析

基本信息

批准号：
14780542
负责人：
森博幸
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

(目的)タンパク質膜透過反応は、膜透過「チャンネル」を介して起こる。膜透過チャンネルは、膜の透過障壁としての機能を保ちつつ、巨大なタンパク質分子を膜透過させる極めて厳密なゲート制御の機構を保持しているが、その実体は不明である。膜透過反応を分子レベルで理解する為には、膜透過チャンネルの構造生物学的解析は欠かせない。主要な構成因子であるSecYは10回の膜貫通領域を持つ疎水的なタンパク質であり、大量発現、精製等には多くの困難を伴う。本研究では、タンパク質の精製・結晶化に有利であると考えられる高度好熱菌Thermus thermophilus HB8を材料として、SecYE膜透過装置の構造生物学的解析を目的としている。(成果)昨年度までに、高度好熱菌T. thermophilus HB8由来のSecYE複合体(TSecYE)の過剰発現用プラスミドの構築、発現系の改良、精製系の確立に成功し、純度95%以上のT. SecYE複合体をmg単位で精製できる系を確立した。精製T. SecYEを組み込んだ再構成プロテオリポソームを用いたin vitro膜透過実験より、精製TSecYE複合体は、TSecA, ATPに依存したタンパク質膜透過活性を保持していることを明らかにした。TSecYE複合体の結晶化を種々の条件で検討し、現在までに6Åの反射を与える結晶を再現性よく得る条件を決定した。現在、さらなる条件検討を進めており、今後の構造解析に期待が持てる。平行して、膜透過駆動モーターTSecAATPaseの発現精製系も確立し、その立体構造をX線結晶解析により決定した。単量体の構造は、先に報告された枯草菌の構造と類似していたが、2量体の形成の様式が全く異なるという特徴が見られた。立体構造を基に、作製したモノシステイン変異体を用いた架橋実験より、我々が決定した2量体が、溶液中で存在していることが明らかとなった。

（目的）蛋白质膜渗透反应通过膜渗透“通道”发生。膜可渗透通道保留其作为膜渗透屏障的功能，同时仍然保留了非常严格的门控机制，该机制允许大型蛋白质分子穿透膜，但其真实本质尚不清楚。膜渗透通道的结构生物学分析对于了解分子水平上的膜渗透反应至关重要。主要成分Secy是一种具有10个跨膜区域的疏水蛋白，并且在大量表达和纯化中遇到许多困难。这项研究旨在分析使用高嗜热细菌嗜热细菌HB8的Secye膜渗透器的结构生物学过程，这被认为对蛋白质纯化和结晶而言是有利的。（结果）到去年，我们已经成功构建，改进了表达系统，并建立了一种质粒，用于过表达Secye复合物（Tsecye）（Tsecye），这些secye络合物（Tsecye）源自高度嗜热细菌T. thermophilus hb8，并建立了一个可以纯化具有95％纯度的Secye络合物的系统。使用纯化的T. secye的重构蛋白脂质体使用重构的蛋白脂质体的体外膜通透实验表明，纯化的Tsecye复合物保留了取决于TSECA和ATP的蛋白质膜通透性活性。在各种条件下研究了Tsecye复合物的结晶，并确定条件以获得迄今为止6Å反射的晶体，具有出色的可重复性。我们目前正在进一步考虑条件，我们可以期待未来的结构分析。同时，还建立了用于膜渗透驱动的运动TsecaATPase的表达纯化系统，并通过X射线晶体学确定其三维结构。单体的结构与先前报道的枯草芽孢杆菌的结构相似，但发现区别是二聚体的形成完全不同。使用基于三维结构制备的单核粉突变体的交联实验表明，溶液中确定的二聚体存在。