高度好熱菌SecYEタンパク質膜透過チャンネルの構造生物学的解析

超嗜热SecYE蛋白膜通透性通道的结构生物学分析

基本信息

批准号：
14780542
负责人：
森博幸
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

(目的)タンパク質膜透過反応は、膜透過「チャンネル」を介して起こる。膜透過チャンネルは、膜の透過障壁としての機能を保ちつつ、巨大なタンパク質分子を膜透過させる極めて厳密なゲート制御の機構を保持しているが、その実体は不明である。膜透過反応を分子レベルで理解する為には、膜透過チャンネルの構造生物学的解析は欠かせない。主要な構成因子であるSecYは10回の膜貫通領域を持つ疎水的なタンパク質であり、大量発現、精製等には多くの困難を伴う。本研究では、タンパク質の精製・結晶化に有利であると考えられる高度好熱菌Thermus thermophilus HB8を材料として、SecYE膜透過装置の構造生物学的解析を目的としている。(成果)昨年度までに、高度好熱菌T. thermophilus HB8由来のSecYE複合体(TSecYE)の過剰発現用プラスミドの構築、発現系の改良、精製系の確立に成功し、純度95%以上のT. SecYE複合体をmg単位で精製できる系を確立した。精製T. SecYEを組み込んだ再構成プロテオリポソームを用いたin vitro膜透過実験より、精製TSecYE複合体は、TSecA, ATPに依存したタンパク質膜透過活性を保持していることを明らかにした。TSecYE複合体の結晶化を種々の条件で検討し、現在までに6Åの反射を与える結晶を再現性よく得る条件を決定した。現在、さらなる条件検討を進めており、今後の構造解析に期待が持てる。平行して、膜透過駆動モーターTSecAATPaseの発現精製系も確立し、その立体構造をX線結晶解析により決定した。単量体の構造は、先に報告された枯草菌の構造と類似していたが、2量体の形成の様式が全く異なるという特徴が見られた。立体構造を基に、作製したモノシステイン変異体を用いた架橋実験より、我々が決定した2量体が、溶液中で存在していることが明らかとなった。

（目的）蛋白质膜渗透反应通过膜渗透“通道”发生。膜渗透通道维持着极其严格的门控制机制，允许大蛋白质分子通过膜，同时保持膜作为渗透屏障的功能，但其实际性质尚不清楚。为了在分子水平上理解膜渗透反应，膜渗透通道的结构生物学分析至关重要。主要成分SecY是一种具有10个跨膜区的疏水性蛋白，其大规模表达和纯化较为困难。在本研究中，我们的目标是使用高嗜热细菌Thermus thermophilus HB8对SecYE膜渗透装置进行结构生物学分析，该细菌被认为有利于蛋白质纯化和结晶。（结果）截至去年，我们成功构建了源自高度嗜热菌T.thermophilus HB8的SecYE复合物（TSecYE）过表达质粒，改进了表达系统，并建立了纯化系统，得到了具有我们建立了一个可以以毫克为单位纯化 SecYE 复合物的系统。使用掺入纯化的 T.SecYE 的重构蛋白脂质体进行的体外膜渗透实验表明，纯化的 TSecYE 复合物保留了 TSecA 和 ATP 依赖性蛋白膜渗透活性。我们研究了 TSecYE 配合物在各种条件下的结晶，到目前为止，我们已经确定了能够以良好的重现性获得反射率为 6 Å 的晶体的条件。我们目前正在研究进一步的条件，并期待未来的结构分析。同时，我们还建立了跨膜驱动马达TSecAATPase的表达和纯化系统，并通过X射线晶体学测定了其三维结构。单体结构与之前报道的枯草芽孢杆菌结构相似，但二聚体形成模式完全不同。使用基于三维结构制备的单半胱氨酸突变体的交联实验表明，我们确定的二聚体存在于溶液中。