In vivo光架橋実験によるタンパク質膜透過装置の相互作用ネットワーク解析

利用体内光交联实验分析蛋白质膜渗透装置的相互作用网络

• 批准号: 19657061
• 负责人: 森 博幸
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19657061/
• 关键词: in vivo光架橋; SecA; タンパク質膜透過; SecY; SecG; translocon; pBPA; アミノ酸アナログ; SecYEG; SecDF; Protein translocation

タンパク質膜透過装置SecYEGのサブユニットの1つであるSecGの全領域(2本の膜貫通領域と細胞質領域、ペリプラズム領域各1つ)を対象に、計37個のamber変異体をplasmid上に作製し、この部位にpBPAを導入したin vivo光架橋実験を行った。その結果、SecGの細胞質領域は、モータ因子SecA ATPase,チャネルの基幹因子SecYと近接していることが明らかとなった。これら因子との相互作用部位は、重複しているが、その作用様式は、SecAのヌクレオチド結合状態に依存して変化し、ATP結合型の条件では、SecAはSecGにより近接することを見いだした。加えて、SecGの第2の膜貫通領域内にpBPAを導入したある変異体においては、SecYとの間で架橋複合体を形成することを明らかにした。この結果は、本in vivo光架橋実験は、膜貫通領域内の相互作用解析においても有用であることを示している。更に、SecGの第2の膜貫通領域と細胞質領域の境界に位置する52番目、あるいはペリプラズム領域との境界に位置する72番目のアミノ酸をpBPAに改変したSecG変異体を用いた場合には、既存のSec因子に対する抗体とは反応せず、電気泳動上移動度の異なる新たな架橋複合体のバンドが検出された。C末端に付加したHis6タグ配列を利用した親和クロマトグラフィーにより架橋複合体を精製し、質量分析により相手の同定を行った所、前者は、機能未知の細胞質膜タンパク質であることが明らかとなった。現在、同定された因子が真に架橋パートナーであるかどうかの検証を進めている。以上のように、部位特異的in vivo光架橋実験は、既存因子のみならず、未知因子との相互作用解析にも威力を発揮する画期的手法として、今後の応用が期待される。

在整个SECG区域，总共制备了37个琥珀突变体，蛋白质膜通透性剂Secyeg的一个亚基之一（两个跨膜区域，一个细胞质区域和一个细胞质区域），一个细胞质区域），以及在Vivo Photoprosslink链接实验中，PBPA在此介绍了该点。结果，揭示了SECG的细胞质区域与运动因子SECA ATPase和通道的核心因子SECY紧密近。尽管与这些因素的相互作用位点重叠，但作用方式的变化取决于SECA的核苷酸结合状态，在ATP结合条件下，SECA更接近SECG。此外，有发现在某些突变体中，在SECG的第二个跨膜区域中引入了PBPA，这是一种由SECY形成的交联络合物。结果表明，该体内光链接实验在跨膜区域内相互作用的分析也很有用。此外，当使用SECG突变体，其中位于SECG第二跨膜区域和细胞质区域之间的边界处的氨基酸时，或在周围区域之间的边界处，将其与抗体基于SEC的相互依据反应的新交叉链接相互反应，将其与新的交叉络合物的反应反应。使用附着在C末端的HIS6 TAG序列纯化交联的复合物通过亲和色谱纯化，并通过质谱法鉴定了伴侣，并且发现前者是具有未知功能的细胞质膜蛋白。我们目前正在努力验证确定的因素是否真正是交联的合作伙伴。如上所述，预计将来将使用特定地点的体内光链接实验作为一种开创性技术，不仅对现有因素有效，而且对与未知因素的相互作用分析也是有效的。

项目成果

Conformational transition of Sec machinery inferred from bacterial SecYE structures.

• DOI: 10.1038/nature07421
• 发表时间: 2008-10-16
• 期刊: NATURE
• 影响因子: 64.8
• 作者: Tsukazaki, Tomoya;Mori, Hiroyuki;Fukai, Shuya;Ishitani, Ryuichiro;Mori, Takaharu;Dohmae, Naoshi;Perederina, Anna;Sugita, Yuji;Vassylyev, Dmitry G.;Ito, Koreaki;Nureki, Osamu
• 通讯作者: Nureki, Osamu

SecA ATPaseはどのようにtransloconと相互作用し、タンパク質膜透過を駆動しているのか?

SecA ATPase 如何与易位子相互作用并驱动蛋白质膜渗透？

• 发表时间: 2008
• 作者: 森 博幸、塚崎智也;濡木理、伊藤維昭
• 通讯作者: 濡木理、伊藤維昭

Crystal structure of T. thermophilus Sec translocon with an Fab fragment implies a translocation-initiating state of SecY.

带有 Fab 片段的嗜热嗜热菌 Sec 易位子的晶体结构表明 SecY 处于易位起始状态。

• 发表时间: 2008
• 作者: Tsukazaki;T.;Mori;H.;et al. (計11名)
• 通讯作者: et al. (計11名)