In vivo光架橋実験によるタンパク質膜透過装置の相互作用ネットワーク解析

利用体内光交联实验分析蛋白质膜渗透装置的相互作用网络

基本信息

批准号：
19657061
负责人：
森博幸
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19657061/
关键词：
in vivo光架橋 SecA タンパク質膜透過 SecY SecG translocon pBPA アミノ酸アナログ SecYEG SecDF Protein translocation

项目摘要

タンパク質膜透過装置SecYEGのサブユニットの1つであるSecGの全領域(2本の膜貫通領域と細胞質領域、ペリプラズム領域各1つ)を対象に、計37個のamber変異体をplasmid上に作製し、この部位にpBPAを導入したin vivo光架橋実験を行った。その結果、SecGの細胞質領域は、モータ因子SecA ATPase,チャネルの基幹因子SecYと近接していることが明らかとなった。これら因子との相互作用部位は、重複しているが、その作用様式は、SecAのヌクレオチド結合状態に依存して変化し、ATP結合型の条件では、SecAはSecGにより近接することを見いだした。加えて、SecGの第2の膜貫通領域内にpBPAを導入したある変異体においては、SecYとの間で架橋複合体を形成することを明らかにした。この結果は、本in vivo光架橋実験は、膜貫通領域内の相互作用解析においても有用であることを示している。更に、SecGの第2の膜貫通領域と細胞質領域の境界に位置する52番目、あるいはペリプラズム領域との境界に位置する72番目のアミノ酸をpBPAに改変したSecG変異体を用いた場合には、既存のSec因子に対する抗体とは反応せず、電気泳動上移動度の異なる新たな架橋複合体のバンドが検出された。C末端に付加したHis6タグ配列を利用した親和クロマトグラフィーにより架橋複合体を精製し、質量分析により相手の同定を行った所、前者は、機能未知の細胞質膜タンパク質であることが明らかとなった。現在、同定された因子が真に架橋パートナーであるかどうかの検証を進めている。以上のように、部位特異的in vivo光架橋実験は、既存因子のみならず、未知因子との相互作用解析にも威力を発揮する画期的手法として、今後の応用が期待される。

在针对 SecG（蛋白质膜透化剂 SecYEG 的亚基之一）的所有区域（两个跨膜区域、一个细胞质区域和一个周质区域）的质粒上总共创建了 37 个琥珀突变体，然后我们进行了体内光交联。将 pBPA 引入该位点的实验。结果表明，SecG 的胞质区域靠近运动因子 SecA ATPase 和关键通道因子 SecY。尽管与这些因子的相互作用位点重叠，但作用模式根据 SecA 的核苷酸结合状态而变化，我们发现在 ATP 结合条件下，SecA 更接近 SecG。此外，我们发现将 pBPA 引入 SecG 的第二跨膜区的突变体与 SecY 形成交联复合物。该结果表明，目前的体内光交联实验对于分析跨膜区域内的相互作用也很有用。此外，当使用位于SecG的第二跨膜区和细胞质区之间的边界的第52个氨基酸、或位于周质区和SecG区之间的边界的第72个氨基酸被修饰为pBPA的SecG突变体时，检测到现有的一条新的交联复合物条带，其不与针对Sec因子的抗体发生反应并且具有不同的电泳迁移率。使用连接到C末端的His6标签序列通过亲和层析纯化交联复合物，并通过质谱鉴定配偶体，结果表明前者是功能未知的细胞质膜蛋白。我们目前正在验证所识别的因子是否确实是交联伙伴。如上所述，位点特异性体内光交联实验有望在未来作为一种创新方法得到应用，该方法不仅可以有效分析与现有因素的相互作用，还可以分析与未知因素的相互作用。

项目成果

期刊论文数量（2）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Conformational transition of Sec machinery inferred from bacterial SecYE structures.

DOI：
10.1038/nature07421
发表时间：
2008-10-16
期刊：
NATURE
影响因子：
64.8
作者：
Tsukazaki, Tomoya;Mori, Hiroyuki;Fukai, Shuya;Ishitani, Ryuichiro;Mori, Takaharu;Dohmae, Naoshi;Perederina, Anna;Sugita, Yuji;Vassylyev, Dmitry G.;Ito, Koreaki;Nureki, Osamu
通讯作者：
Nureki, Osamu

Crystal structure of T. thermophilus Sec translocon with an Fab fragment implies a translocation-initiating state of SecY.

带有 Fab 片段的嗜热嗜热菌 Sec 易位子的晶体结构表明 SecY 处于易位起始状态。