複製開始蛋白質の二量体から単量体変換における分子シャペロンの作用機構の解析

分子伴侣在复制起始蛋白二聚体向单体转化中的作用机制分析

基本信息

批准号：
07253213
负责人：
和田千恵子
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1)大腸菌を宿主として複製するミニFの複製開始頻度は厳密に調節されている。この調節にはミニFの複製開始蛋白質(RepE)が重要な働きをしている。RepEは複製開始因子として、また自己転写抑制因子としての機能を持つ。この特徴は多くの複製開始因子に共通する。我々はこれまでの解析から、RepEのイニシエーター/リプレッサーの機能転換は単量体、二量体の構造変換として理解出来ることを明かにした。この変換に分子シャペロンが関与しているという示唆的データーを得ていたが,このことを精製RepEを用いた実験系を作り、確証する試みをした。マイクロコンによる分子篩法を用いると、単量体(分子量30kDa)は濾液に80〜100%回収されるが、正常RepE(二量体、分子量60kDa)は濾液に3〜7%しか回収されない。しかし4M Guanidine塩酸であらかじめ正常RepEを処理したり、分子シャペロン(DnaK, DnaJ, GrpE)とATPで処理すると濾液に前者は78%,後者は42%回収された。正常RepEが濾液に回収されるにはDnaK, DnaJ, GrpEとATPが必要であること、またこの濾液のゲル濾過カラム溶出パターンから単量体RepEであることを明らかにした。この結果はRepE二量体が分子シャペロン(DnaK, DnaJ, GrpE)とATPによってRepE単量体に変換されることを示している。in vivoにおいても、人工的に細胞内の分子シャペロンの量を増すとRepEのイニシエーター活性が増加することがわかった。このことはRepEのイニシエーター機能の活性化に分子シャペロンが働いていることを示している。2) RepEと分子シャペロンとの相互作用領域、DNA結合ドメイン、二量体形成ドメインを明かにし、分子シャペロンによるRepEの高次構造変化と活性化の機構を分子レベルで明かにするためにはRepEの機能ドメインの解析データーが必須である。RepEのDNA結合ドメインを遺伝学的手法により決めるためにrepE遺伝子の全領域に均一に変異を誘導し、複製開始領域にもオペレーターにも結合出来なくなった変異体を系統的に分離、解析した結果、C末端領域がDNA結合に関与していることを明かにした。

1）以大肠杆菌为宿主进行复制的miniF的复制起始频率受到严格调控。 miniF 复制起始蛋白 (RepE) 在此调节中发挥重要作用。 RepE 充当复制起始因子和自转录抑制因子。这一特征对于许多复制起始因子来说是常见的。从我们之前的分析中，我们发现RepE启动子/阻遏子的功能转换可以理解为单体和二聚体之间的结构变化。我们获得的数据表明分子伴侣参与了这种转化，并且我们尝试通过使用纯化的 RepE 创建实验系统来证实这一点。当使用Microcon的分子筛法时，滤液中回收了80-100%的单体（分子量30 kDa），但滤液中仅回收了3-7%的正常RepE（二聚体，分子量60 kDa）。然而，当正常RepE用4M盐酸胍预处理或用分子伴侣（DnaK、DnaJ、GrpE）和ATP处理时，滤液中回收了前者的78%和后者的42%。滤液中回收正常RepE需要DnaK、DnaJ、GrpE和ATP，从该滤液的凝胶过滤柱洗脱图谱可知，其为单体RepE。该结果表明RepE二聚体通过分子伴侣（DnaK、DnaJ、GrpE）和ATP转化为RepE单体。在体内，我们发现人为增加细胞内分子伴侣的数量会增加RepE引发剂的活性。这表明分子伴侣在激活RepE的启动子功能中发挥作用。 2）为了阐明RepE与分子伴侣之间的相互作用区域、DNA结合域、二聚化结构域，并在分子水平上阐明分子伴侣对RepE构象变化和激活的机制，对RepE功能域的分析数据为基本的。为了利用遗传学方法确定RepE的DNA结合域，我们在repE基因的整个区域中均匀诱导突变，并系统地分离和分析了无法与复制起始区或操纵基因结合的突变体。 C 末端区域参与 DNA 结合。