大腸菌ミニF複製制御機構の解析

大肠杆菌miniF复制控制机制分析

基本信息

批准号：
06247207
负责人：
和田千恵子
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06247207/
关键词：
複数開始蛋白質分子シャペロン RepEドメイン

项目摘要

大腸菌を宿主として複製するミニFの複製開始蛋白質RepEは複製開始頻度の調節のKEY ELEMENTとして注目されているが詳細な機構は明かでない。我々はRepEが持つ二つの機能(イニシエーター、リプレッサー)は各々RepE単量体と二量体に対応しており、イニシエーター/リプレッサーの機能変換が単量体と二量体の構造変換として理解出来る事を明きらかにした。この二量体から単量体への変換に分子シャペロン(DnaK,DnaJ,GrpE)が関与している可能性を今年度検討した。さらにミニFのコピー調節におけるincC領域の役割を研究する計画をしていたが、ミニFの試験管内DNA合成系の準備をしたにとどまった。然し、RepEのドメインに関して重要な進展があった。今年度の研究実績を以下に記す。(1)正常RepEの複製開始領域(DR)、オペレーター(IR)への結合に及ぼすDnak,DnaJの効果をDR又はIRのDNAをプローブにして精製RepE,DnaK,DnaJを用いてゲルシフトAssayで調べた。RepEのDRへの結合能はDnaK,DnaJ,ATPの量に比例してDRへの結合能が増大する事が明かとなり、RepE二量体がDnaK,DnaJ,ATPにより単量体に変換される事が示唆された。(2)細胞粗抽出液からニッケルアフィニティカラム、架橋剤を用いてRepEと分子シャペロンとの複合体を見つけることが出来た。(3)RepEの種々の変異体を用いて分子シャペロン(DnaK,DnaJ)との複合体の形成能を調べることにより、RepEの分子シャペロンとの相互作用領域を決定した。(4)oriCDNA複製がみられるフラクションIIが調整出来た。RepEに依存したミニFの複製が行われるかどうか?DnaK,DnaJ,GrpEによって促進されるかどうか?等を今後調べる予定である。(5)RepEの複製開始領域(DR),オペレーター(IR)への結合に関与する領域の決定:RepE遺伝子にPCRによりランダムに変異を導入し、DNA結合能を失った変異体だけを選択できる系を作り、系統的に解析した結果、RepEのC末領域に変異体が集中し、この領域がDNA結合ドメインであろうと結論した。(J.Bact.,1995,4月号掲載予定)

复制大肠杆菌作为宿主的Mini -F的重复蛋白质吸引了注意作为调节重复频率的关键要素，但详细的机制尚不清楚。我们有两个函数（启动器，阻遏者），每个功能都与单个和双重的兼容，而启动器/抑制器的功能转换是Monas和Double Bodies之间的结构转换。今年，我们研究了分子cheperon（DNAK，DNAJ，GRPE）的可能性，将参与从双体转换为单体的转换。此外，他还计划研究INCC区域在Mini -F的拷贝控制中的作用，但仅准备在Mini -F测试管中进行DNA合成。但是，报告领域取得了重要的进展。今年的研究结果如下所述。（1）使用DNAK和DNAJ对重复启动区（DR）和操作员（IR）的影响，研究了DNAK，DNAJ的效果，是DNAK，DNAJ，是DNAK，DNAJ，是DNAK，DNAJ，是DNAK，DNAJ，是DNAK和DNAJ的效果。正常的ta。显然，与DR的结合与DNAK，DNAJ和ATP的数量成正比，并通过DNAK，DNAJ和ATP转换为单体。（2）从细胞粗糙提取物中，可以使用镍亲和力柱和交叉链接发现repe和分子分子伴侣之间的复合物。（3）通过使用各种repe使用分子cheperon（DNAK，DNAJ）检查复合材料形成，确定了与分子分子分子分子伴侣分子分子伴侣的相互作用面积。（4）调整了可以看到OricDNA重复的馏分II。我们计划调查Mini -F的重复是否取决于Repe，是否将来由DNAK，DNAJ，GRPE等促进。（5）确定重复区域（DR）的区域，Repe代表的操作员（IR）：随机部署在报告基因中，并且只能选择丢失DNA键的可变体。和分析系统，我们得出的结论是，突变体集中在C的C的末端，并且该区域将是DNA结合结构域。（J.Bact。，1995年，4月发行，计划发布）