分子シヤペロンによるDNA複製開始タンパク質(RepE)の活性化の分子機構:RepE-分子シャペロン複合体の構造解析と形成機構及びRepE二量体ドメインの構造解析

分子伴侣激活DNA复制起始蛋白(RepE)的分子机制：RepE-分子伴侣复合物的结构分析和形成机制以及RepE二聚体结构域的结构分析

基本信息

批准号：
14037235
负责人：
和田千恵子
金额：
$ 3.01万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

大腸菌を宿主として増殖するミニFプラスミドの複製開始タンパク質RepEは二つの機能・すなわち複製開始因子として、二つ目にはrepE遺伝子の自己転写抑制因子として働く。前者はRepE単量体が、後者はRepE二量体が機能する。二量体から単量体への変換はDnaK分子シャペロンによって行われることを我々は明らかにした。この変換機構の詳細を分子レベルで明らかにするのが本研究の目的である。平成14年度は3つの課題を予定していたが、二つの課題について研究実績を報告する。(1)分子シャペロンとの相互作用が出来なくなったRepE変異体を分離し、それらの変異体の解析によりDnaK分子シャペロンとの相互作用領域を決める。新たに16個の変異体をPCR mutagenesisを用いて、分離した。これらの変異体の自己転写抑制活性は正常であり、二量体は形成できるが、オリジンの繰り返し配列には結合出来ない性質を示すものとして分離した。さらにこれらの変異体の変異位置を決めた。N末ドメインに変異が位置づけられた。今後DnaK, DnaJ, GrpEとこれら変異RepEの間の相互作用を調べる予定である。(2)RepE二量体の結晶化と構造解析。正常RepE二量体はタンパク質が凝集しやすく結晶化が困難であるから、N末ドメイン(分子量約15kD)の結晶化を試みた。この断片RepEタンパク質は二量体であることを二つの方法を用いて、確かめた。また結晶化に成功した。現在、解像度が上げる試み、重原子を入れる試みをしている。次に構造解析を行う。

Mini -F质粒重复启动蛋白增殖为宿主，是两个功能，是重复的起始因子，第二个功能是repu基因的自我转录因子。前者具有repe单体的功能，后者在repe double中起作用。我们已经揭示了从双体向单体的转化是由DNAK分子分子进行的。这项研究的目的是阐明该转化机制在分子水平上的细节。在2002年，计划了三个问题，但我们将在两个问题上报告他们的研究结果。（1）单独的repe突变体，该突变体已无法与分子分子冠状管相互作用，并通过分析这些变体来确定与DNAK分子分子分子的相互作用面积。使用PCR诱变分离了16种新变体。这些变体的自我转录抑制活性是正常的，并且可以形成双主体，但是将其分开为表明不能与原点的重复阵列结合的属性。此外，确定了这些突变体的突变体位置。一个突变位于n端域中。将来，我们计划检查DNAK，DNAJ，GRPE和这些突变之间的相互作用。（2）复制双体的结晶和结构分析。正常的双体易于聚集蛋白，并且难以结晶，因此我们试图结晶N端域（分子量约15 kD）。使用两种方法证实了碎片的蛋白质，该蛋白是双体。此外，我们成功地结晶了。目前，我们正在尝试提高分辨率，并尝试放入Shighara -Gi。接下来，进行结构分析。