大腸菌ミニFDNA複製制御機構:イテロンによるDNA複製阻害とその解除機構の解析

大肠杆菌mini-FDNA复制控制机制：iteron对DNA复制抑制及其释放机制分析

基本信息

批准号：
11143206
负责人：
和田千恵子
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1)ミニFプラスミドのDNA複製調節機構大腸菌を宿主として複製するFプラスミドは染色体あたり1〜2個のコピー数で厳密に調節されている。ミニFのDNA複製開始にはFプラスミドの複製開始領域(ori2),複製開始因子(RepE)と宿主染色体のDNA複製開始に必須な宿主蛋白質群が必要である。それらに加えて、分子シャペロン(DnaK,DnaJ,GrpE)を必要とすること、これらは複製開始因子として不活性な二量体RepE(repE遺伝子のリプレッサー機能を持つ)を活性な単量体に変換する役割を担っていることを我々は明らかにした。また活性RepEの細胞内量とincCイテロンはDNA複製開始調節において重要である。incC領域は約300塩基対からなり、複製開始蛋白質が結合する19塩基対(イテロン)からなるイテロンが5個並んでいる。これらは複製開始領域(ori2)にあるイテロンとほぼ同じ構造である。incC領域はori2に対してシス位置にあるときはFプラスミドのコピー数調節の機能、トランスにあるときは不和合性を示す。これらのDNA複製抑制機構を明らかにした。incCイテロンがミニFのDNA複製開始を抑制すること、ori2,incCイテロンにRepEが各々結合し、結合RepEを介してcross-link構造が作られること、この構造が新たな複製開始複合体の形成を阻害することにより新たなDNA複製開始が抑制される可能性が考えられた。さらにCross-link構造形成にはRepEの二量体形成ドメインが係わっていることやRepE-イテロンの正常な結合様式が必要であることを明らかにした。in vitroのDNA複製系でincCイテロンの阻害効果を調べた。その結果は他の実験データとも合わせ考えると正の制御因子の存在を示唆した。このようなDNA複製の調節機構はFプラスミドに限らず、Fプラスミド類似のプラスミド、バクテリアやある種のDNAウイルスにもみられ、共通の機構で理解出来ると考えている。2)RepE54-Iteronの共結晶構造DNA複製開始蛋白質としては初めての結晶構造解析に成功した。

1) mini-F质粒的DNA复制控制机制 F质粒在作为宿主的大肠杆菌中复制，每条染色体受到1至2个拷贝的严格调控。 MiniF DNA 复制起始需要 F 质粒的复制起始区 (ori2)、复制起始因子 (RepE) 和宿主染色体中 DNA 复制起始所必需的宿主蛋白。此外，它还需要分子伴侣（DnaK、DnaJ、GrpE），将无活性的二聚体RepE（具有repE基因的阻遏功能）转化为活性单体作为复制起始因子。在改变世界中发挥作用。此外，细胞内活性 RepE 和 incC iteron 的数量对于调节 DNA 复制起始也很重要。 incC 区域由大约 300 个碱基对组成，并排列着 5 个迭代子，每个迭代子由 19 个碱基对（迭代子）组成，复制起始蛋白与其结合。这些结构与复制起始区（ori2）中的迭代子几乎相同。 incC 区域相对于 ori2 位于顺式时可调节 F 质粒的拷贝数，而位于反式时表现出不相容性。我们阐明了这些 DNA 复制抑制机制。 incC iteron 抑制 miniF DNA 复制起始，RepE 与 ori2 和 incC iteron 结合，通过结合的 RepE 创建交联结构，并且该结构形成新的复制起始复合物，人们认为新的 DNA 复制的起始。通过抑制来抑制此外，我们还发现RepE的二聚结构域参与了交联结构的形成，并且需要RepE-iteron的正常结合模式。在体外 DNA 复制系统中研究了 incC iteron 的抑制作用。结果与其他实验数据一起表明存在正控制因素。这种DNA复制的调节机制不仅在F质粒中观察到，而且在与F质粒类似的质粒、细菌和某些DNA病毒中也观察到，我们相信可以通过共同的机制来理解它。 2) RepE54-Iteron的共晶结构我们首次成功分析了DNA复制起始蛋白的晶体结构。