BN-PAGEを用いた大腸菌膜プロテアーゼ複合体の解析

使用 BN-PAGE 分析大肠杆菌膜蛋白酶复合物

基本信息

批准号：
11878132
负责人：
小椋光
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

膜プロテアーゼFtsHとその調節タンパク質の複合体を、膜に存在する(インタクトな)状態を維持したままで解析することを目的としてBN-PAGEの適用を試みてきた。そのために、(1)膜に存在するFtsH複合体をインタクトなまま可溶化する条件の確立と(2)大腸菌タンパク質の解析におけるBN-PAGE法の確立をめざしてきた。しかし、残念ながらFtsH複合体をインタクトなまま可溶化する有効な条件を確立することはできなかった。可溶化力の異なる界面活性剤を試し、また可溶化力の弱い界面活性剤と強い界面活性剤を組み合わせるなどの条件を検討したが、良好な結果を得ることはできなかった。BN-PAGEが発表されて10年が経つが、大腸菌を始め細菌の膜タンパク質複合体の解析への応用例はこれまで報告されていない。大腸菌の膜タンパク質の可溶化条件が厳しく、このことがBN-PAGEの大腸菌における応用を難しくしている要因であると思われる。新たな界面活性剤の開発などが必要かもしれない。結果として、現時点ではBN-PAGEを大腸菌で確立することはできなかったが、この研究中に温度感受性ftsH変異株の新しい表現型としてミニFプラスミドの分配阻害を見いだした。ミニFプラスミドの分配装置は膜上の特定の位置に形成されるタンパク質複合体と考えられている。分配装置の解析から今後新たな突破口が開ける可能性もあり、その意味においては一定の成果を得ることができた。

我们尝试应用 BN-PAGE 分析膜蛋白酶 FtsH 及其调节蛋白的复合物，同时保持其在膜中的完整状态。为此，我们的目标是 (1) 建立溶解膜中存在的 FtsH 复合物并保持完整的条件，以及 (2) 建立用于分析大肠杆菌蛋白的 BN-PAGE 方法。然而不幸的是，我们无法建立有效的条件来溶解 FtsH 复合物，同时保持其完整。尽管我们尝试了不同增溶能力的表面活性剂，并考虑了将增溶能力弱的表面活性剂与强增溶能力的表面活性剂组合等条件，但我们未能获得良好的结果。 BN-PAGE问世已有10年，但迄今为止尚未见其应用于大肠杆菌等细菌膜蛋白复合物分析的报道。大肠杆菌膜蛋白的溶解条件很严格，这似乎是难以将BN-PAGE应用于大肠杆菌的一个因素。可能有必要开发新的表面活性剂。因此，我们此时无法在大肠杆菌中建立 BN-PAGE，但在这项研究中，我们发现对 miniF 质粒分配的抑制是温度敏感的 ftsH 突变体的新表型。 miniF质粒的分布装置被认为是在膜上特定位置形成的蛋白质复合物。从分配装置的分析来看，未来有可能会取得新的突破，从这个意义上说，我们取得了一定的成功。