原核細胞のATP依存性膜結合型メタプロテアーゼFtsHの研究

原核ATP依赖性膜结合蛋白酶FtsH的研究

基本信息

批准号：
08278227
负责人：
小椋光
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08278227/
关键词：
FtsH プロテアーゼ蛋白分解 ATPase AAAファミリー蛋白 σ^<32>胞子形成

项目摘要

FtsHプロテアーゼの機能ドメインの解明:FtsH蛋白のAAAモジュール、Zn結合モチーフ及び膜結合ドメインの機能を解析するため、欠失変異や部位特異的変異を導入し、これらの変異FtsHのプロテアーゼ活性をσ^<32>のレベルを指標にin vivoで調べた。その結果、AAAモジュール内のWalkerモチーフ、SRH領域はプロテアーゼ活性に重要であることが判明した。またZn結合の変異もプロテアーゼ活性を失った。膜結合ドメインを欠いたFtsHは活性は落ちるが、過剰は産生すると有意にプロテアーゼ活性を示した。また、これらの変異FtsH蛋白を温度感受性ftsH1変異株で発現したところ、プロテアーゼ触媒部位のグルタミン酸残基をグルタミンに置換した変異が温度感受性を相補し、プロテアーゼ活性を示すことが分かった。この変異蛋白は単独ではプロテアーゼ活性を示さないことから、FtsH1蛋白との複合体として活性を持つことが強く示唆された。FtsHプロテアーゼによる基質認識:σ^<32>のC領域に相当する合成ペプチドを基質として、in vitroの系でFtsHによる分解を調べたところ、このペプチドは複数箇所切断されることが分かった(Bukauとの共同研究)。λCIIIの活性領域に相当する24アミノ酸残基のペプチドはin vitroでFtsHのプロテアーゼ活性を強く阻害した。FtsHプロテアーゼと枯草菌の胞子形成蛋白SpoVMの相互作用:枯草菌の胞子形成に関わる26アミノ酸残基の蛋白SpoVMはin vitro系で大腸菌FtsHプロテアーゼ活性を特異的に阻害するとともにそれ自身基質として分解されることを明らかにした。spoVM変異を抑制するftsH変異の変異箇所を決定したところ、Zn結合モチーフ(プロテアーゼ活性部位)のすぐ上流部位であった(Cuttingとの共同研究)。

FtsH蛋白酶功能域的阐明：为了分析FtsH蛋白的AAA模块、Zn结合基序和膜结合域的功能，引入了缺失突变和位点特异性突变，并对FtsH蛋白的蛋白酶活性进行了分析。这些突变体FtsH为σ^<32>的水平在体内进行了研究。结果发现 AAA 模块内的 Walker 基序和 SRH 区域对于蛋白酶活性非常重要。锌结合的突变也丧失了蛋白酶活性。缺乏膜结合结构域的 FtsH 活性降低，但当产生过量时，它表现出显着的蛋白酶活性。此外，当这些突变型FtsH蛋白在温度敏感型ftsH1突变株中表达时，发现蛋白酶催化位点中的谷氨酸残基被谷氨酰胺取代的突变补充了温度敏感性并表现出蛋白酶活性。由于该突变蛋白单独不显示蛋白酶活性，因此强烈表明它具有与 FtsH1 蛋白的复合物的活性。 FtsH 蛋白酶的底物识别：当我们使用对应于 σ^<32> C 区的合成肽作为底物在体外系统中检查 FtsH 的降解时，我们发现该肽在多个位点被切割（Bukau 关节）研究）。对应于λCIII活性区的24个氨基酸残基肽在体外强烈抑制FtsH的蛋白酶活性。 FtsH 蛋白酶与枯草芽孢杆菌孢子形成蛋白 SpoVM 之间的相互作用：SpoVM 是一种参与枯草芽孢杆菌孢子形成的 26 个氨基酸残基蛋白，在体外系统中特异性抑制大肠杆菌 FtsH 蛋白酶活性，并且其本身作为底物被降解。透露当我们确定抑制 spoVM 突变的 ftsH 突变的突变位点时，发现它位于 Zn 结合基序（蛋白酶活性位点）的紧上游（与 Cutting 的联合研究）。