悪性細胞に特有の細胞基質間接着構造の分子構築と機能解析

恶性细胞特有的细胞基质粘附结构的分子构建和功能分析

基本信息

批准号：
06281238
负责人：
祖父江憲治
金额：
$ 2.56万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ガン細胞あるいは悪性形質転換細胞における接着構造の機能とこれを構成するアクチン系細胞骨格の機能及び制御機能を明らかにすることは、がンの転移浸潤機構を理解するうえで重要である。本研究では、正常線維芽細胞とラウス肉腫ウイルスにより形質転換した細胞を比較することにより、形質転換細胞では運動性に富む動的接着部と静的な辺縁接着部の2種類の接着部位が形成されること、および動的接着部にはアクチン、ミオシン、カルデスモン(CaD)、トロポミオシンなどの収縮蛋白質が集積されることを見い出した。しかしながら、CaDは、正常細胞に比較して腫瘍細胞で発現量が著名に低下していた。この様な組織、細胞特異的なCaDの発現機構を解析するため、すでにクローニングずみのプロモーター領域をCAT遺伝子の上流に挿入したプラスミド及びこれ由来の一連の欠失変異プラスミドを構築した。これらのプラスミドを分化型形質を維持した平滑筋初代培養細胞及び脱分化型平滑筋細胞にトランスフェクションし、CATアッセイを行った。同様の解析をびHeLa細胞を用いておこなった。また、ゲルシフトアッセイによりDNAと核蛋白質の相互作用を解析した。その結果、CaDプロモーターは分化型平滑筋細胞において高い転写活性を示した。脱分化型平滑筋細胞では転写活性は抑制を受け前者の70〜40%程度であった。HeLa細胞での転写活性はさらに低く分化型平滑筋細胞における活性の10%以下であった。これらの結果はそれぞれの細胞でのCaD蛋白質の発現量と一致しており、CaDの組織特異的な発現は転写レベルで制御されていることが明らかになった。この分化型平滑筋細胞特異的な転写促進は転写開始部位の上流-309〜300に位置するCArGbox様配列(CCAAAAAAGG)に依存しており、この配列と前後6bpを含む配列CArG1と特異的に結合する核蛋白質が平滑筋細胞核抽出液中に存在することを見出した。以上の結果、このCArGbox様配列はCaDの平滑筋特異的な発現を制御している唯一のシス因子であることが明かになった。さらにガン細胞でCaD遺伝子のプロモーター解析を行い、転写制御の違いやガン細胞での転写抑制の要因を明らかにする必要がある。

重要的是要了解癌细胞或恶性转化细胞中粘附结构的功能和调节功能，以及构成肌动蛋白细胞骨架的功能和调节功能，以了解该属的转移性侵袭机制。在这项研究中，通过比较正常的成纤维细胞和通过ROUS肉瘤病毒转化的细胞，我们发现在转化的细胞中形成了两种类型的粘附位点：动态和静态粘附位点，以及肌动蛋白，肌球蛋白，Caldesmon（CAD）和Tropomyosin等收缩蛋白（如肌动蛋白，肌球蛋白，CAD），以及热瘤的粘附点积累。然而，与正常细胞相比，肿瘤细胞中CAD的表达水平显着降低。为了分析组织特异性的CAD表达机制，构建了质粒，其中将克隆的核的启动子区域插入了CAT基因的上游，并构建了一系列从中构建的缺失突变质粒。将这些质粒转染到原发性培养的平滑肌细胞中，并推断出维持分化性状的平滑肌细胞，然后进行猫测定。使用HeLa细胞进行了类似的分析。另外，通过凝胶转移测定法分析了DNA与核蛋白之间的相互作用。结果，CAD启动子在分化的平滑肌细胞中显示出较高的转录活性。去分化的平滑肌细胞的转录活性约为前者的70-40％。 HeLa细胞中的转录活性甚至较低，在分化的平滑肌细胞中少于10％。这些结果与每个细胞中CAD蛋白的表达水平一致，表明CAD的组织特异性表达在转录水平上受到调节。这种分化的平滑肌细胞特异性转录促进取决于cargbox样序列（CCAAAAAAGG）位于转录起始位点（CCAAAAAAAGG）上游的caaaaaaagg（CCAAAAAAGG），并且发现一种核蛋白特异性地与该序列结合的核蛋白与该序列carg1结合，其中包含序列6BP，它是平滑型细胞中的序列6BP。结果，已经揭示了这种cargbox样序列是调节CAD平滑肌特异性表达的唯一顺式因素。此外，必须对癌细胞中CAD基因进行启动子分析，以阐明转录调控的差异以及导致癌细胞转录抑制的因素。