悪性細胞に特有の細胞基質間接着構造の分子構築と機能解析

恶性细胞特有的细胞基质粘附结构的分子构建和功能分析

基本信息

批准号：
06281238
负责人：
祖父江憲治
金额：
$ 2.56万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ガン細胞あるいは悪性形質転換細胞における接着構造の機能とこれを構成するアクチン系細胞骨格の機能及び制御機能を明らかにすることは、がンの転移浸潤機構を理解するうえで重要である。本研究では、正常線維芽細胞とラウス肉腫ウイルスにより形質転換した細胞を比較することにより、形質転換細胞では運動性に富む動的接着部と静的な辺縁接着部の2種類の接着部位が形成されること、および動的接着部にはアクチン、ミオシン、カルデスモン(CaD)、トロポミオシンなどの収縮蛋白質が集積されることを見い出した。しかしながら、CaDは、正常細胞に比較して腫瘍細胞で発現量が著名に低下していた。この様な組織、細胞特異的なCaDの発現機構を解析するため、すでにクローニングずみのプロモーター領域をCAT遺伝子の上流に挿入したプラスミド及びこれ由来の一連の欠失変異プラスミドを構築した。これらのプラスミドを分化型形質を維持した平滑筋初代培養細胞及び脱分化型平滑筋細胞にトランスフェクションし、CATアッセイを行った。同様の解析をびHeLa細胞を用いておこなった。また、ゲルシフトアッセイによりDNAと核蛋白質の相互作用を解析した。その結果、CaDプロモーターは分化型平滑筋細胞において高い転写活性を示した。脱分化型平滑筋細胞では転写活性は抑制を受け前者の70〜40%程度であった。HeLa細胞での転写活性はさらに低く分化型平滑筋細胞における活性の10%以下であった。これらの結果はそれぞれの細胞でのCaD蛋白質の発現量と一致しており、CaDの組織特異的な発現は転写レベルで制御されていることが明らかになった。この分化型平滑筋細胞特異的な転写促進は転写開始部位の上流-309〜300に位置するCArGbox様配列(CCAAAAAAGG)に依存しており、この配列と前後6bpを含む配列CArG1と特異的に結合する核蛋白質が平滑筋細胞核抽出液中に存在することを見出した。以上の結果、このCArGbox様配列はCaDの平滑筋特異的な発現を制御している唯一のシス因子であることが明かになった。さらにガン細胞でCaD遺伝子のプロモーター解析を行い、転写制御の違いやガン細胞での転写抑制の要因を明らかにする必要がある。

阐明癌细胞或恶性转化细胞中粘附结构的功能以及构成这些结构的基于肌动蛋白的细胞骨架的功能和控制功能对于理解癌症转移和侵袭的机制具有重要意义。在这项研究中，通过比较正常成纤维细胞和劳斯肉瘤病毒转化的细胞，我们发现转化细胞有两种类型的粘附位点：高度运动的动态粘附和静态边缘粘附。钙结合蛋白 (CaD) 和原肌球蛋白在动态粘连时积累。然而，与正常细胞相比，肿瘤细胞中CaD的表达水平显着降低。为了分析CaD的组织和细胞特异性表达机制，我们构建了一个质粒，其中在CAT基因上游插入了先前克隆的启动子区域，以及一系列源自该质粒的缺失突变体质粒。将这些质粒转染至原代培养的保持分化性状的平滑肌细胞和去分化的平滑肌细胞中，并进行CAT测定。使用 HeLa 细胞进行了类似的分析。此外，使用凝胶位移测定分析了DNA和核蛋白之间的相互作用。结果，CaD启动子在分化的平滑肌细胞中表现出高转录活性。在去分化的平滑肌细胞中，转录活性被抑制到前者的约 70-40%。 HeLa细胞中的转录活性甚至更低，不到分化平滑肌细胞活性的10%。这些结果与每个细胞中 CaD 蛋白的表达水平一致，表明 CaD 的组织特异性表达在转录水平受到调节。这种分化的平滑肌细胞特异性转录促进依赖于位于转录起始位点-309至300上游的CArGbox样序列（CCAAAAAAGG），并特异性结合序列CArG1，该序列包括该序列以及前后6个bp。之后我们发现平滑肌细胞核提取物中存在一种核蛋白。上述结果表明，这种CArGbox样序列是控制CaD平滑肌特异性表达的唯一顺式因子。此外，有必要分析癌细胞中CaD基因的启动子，以阐明癌细胞中转录调控的差异和抑制转录的因素。