Hsc70の核タンパク質輸送における役割の解析

Hsc70在核蛋白转运中的作用分析

基本信息

批准号：
05268223
负责人：
今本尚子
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05268223/
关键词：
70kDa熱ショックタンパク質核タンパク質輸送

项目摘要

本研究はこれまでに同定した、核タンパク質輸送を担う細胞質因子の一つであるhsc70と相互作用する、輸送を担う他の因子の同定とその機能解析を通し、核タンパク質輸送におけるhsc70の役割を明かにすることを目的とする。輸送を担う因子の同定は、digitonin処理で作製したsemi-intact cellを用いたin vitro核タンパク質輸送実験系を導入し、輸送に必要な粗細胞質抽出液を分画し、輸送活性を追跡することにより行なった。粗細胞質抽出液をイオン交換クロマトグラフィーで分画した結果、輸送活性を相補する、低塩濃度で溶出される分画Iと、高塩濃度で溶出される分画IIを得た。輸送活性には両方の分画が必要であり、両方の分画にはhsc70以外の、輸送に必要な因子が含まれていることも判明した。semi-intact cellを核タンパク質と分画II存在下で反応させると、系に加えた核タンパク質はATP非存在下、4℃の条件で核膜表面に結合するが、更に核内に核タンパク質を集積させるためには、分画Iを加え、ATP存在下、30℃でインキュベーションする必要があった。このことから、分画IIは核タンパク質の核膜孔への結合のステップを担い、分画Iは、それに続く核膜孔通過反応を担うことが判った。hsc70が分画IIに依存した核タンパク質の核膜孔へのターゲッテイングのステップを促進したため、分画IIに注目し、この分画に含まれる因子の解析を進めた。分画IIと核タンパク質を反応させると約500kDaの安定なcomplexを形成し単離したこのcomplexそのものが核膜孔へのターゲッテイング活性をもつことがわかった。単離したcomplexは、輸送される核タンパク質と4つの細胞質因子から形成されていることが確認された。核タンパク質が、核膜孔へターゲッテイングするために、細胞質で単離可能な安定なcomplexを形成することが初めて確認されたのと同時に、その構成成分が同定できた研究成果は大きい。今後、単離したcomplexの各構成蛋白を精製し、その構造を決定する。更に、ターゲッテイングcomplexが結合する核膜孔構成タンパク質を同定する。complexの再構成実験及びcomplexと核膜孔との結合反応の解析を通して、これらの反応過程におけるhsc70の役割を明かにする。

这项研究具有HSC70在核蛋白运输中的作用，核蛋白转运与HSC70相互作用，HSC70是负责核蛋白运输的植物因素之一，其目的是揭示其目的。运输因子的鉴定是使用由Digitonin加工产生的半独立性细胞引入体外蛋白运输实验，将所需的粗细细胞提取物划分为运输。由于用离子色谱法对粗细细胞提取物进行了分裂，该分数II以低盐浓度洗脱，与盐浓度相互补充，并且在高盐浓度下洗脱的II分裂II。运输也需要两个部门，并且还发现两个部门都包括HSC70以外的运输所需的因素。当半单个细胞在核蛋白中反应并存在分裂的II时，在没有ATP的情况下将添加到系统的核蛋白在核膜表面键合，但核蛋白在核中进一步是核蛋白为了累积，有必要在ATP的存在中添加分裂I并在30°C下孵化。由此，发现II分区采取了将核蛋白与核膜孔结合的步骤，我将遵循核膜孔。由于HSC70促进了靶向核蛋白靶向核蛋白的核膜孔的步骤，该核蛋白依赖于II II，因此我们专注于Divide II并分析了该分裂中所包括的因素。已经发现，这种复合物本身形成了约500 kDa的稳定复合物，并在II和核蛋白反应时分离出来，它在核孔上具有靶向活性。已经证实，分离的复合物是由转运的核蛋白和四个细胞原因子形成的。首先证实，核蛋白形成了一种稳定的复合物，可以通过细胞质分离以靶向核膜孔，并且可以鉴定出分量很大的研究结果。将来，将纯化隔离复合物的每个构型蛋白，并确定结构。此外，确定了靶向复合物的核孔。 HSC70在这些反应过程中通过复合物的重建实验以及复合物和核膜孔之间的结合反应的分析。