核蛋白質を核膜孔へターゲットする蛋白質複合体の同定及びその構成因子の機能解析

将核蛋白靶向核孔的蛋白质复合物的鉴定及其组成因素的功能分析

基本信息

批准号：
07680768
负责人：
今本尚子
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07680768/
关键词：
核タンパク質輸送核局在化シグナル核膜孔 In vitro輸送系

项目摘要

核蛋白質の核内への移行は、核局在化シグナルに依存した細胞質から核膜孔までの第一のステップと、エネルギーを利用して核膜孔を通過する第二のステップに大きく分けられる。本研究者は、in vivo培養細胞実験系とセミインタクト細胞を用いたin vitro実験系を駆使して、第一のステップに働く細胞質因子の解析を進めた。in vitro実験系を用いた解析より、核蛋白質は細胞質抽出液中で、安定な蛋白質複合体を形成し、この複合体自身が他の因子を必要とせずに核膜孔へ結合する活性をもつことを見い出した。この複合体を、その活性に基づいて「核膜孔ターゲティング複合体」と名付けた。この複合体を構成する因子を精製し、その中の58kDaと97kDaの因子が活性に必須であることを明らかにした。この2因子の部分アミノ酸配列を決定し、遺伝子クローニングに成功した。これらのrecombinant蛋白質を用いた解析から、58kDa因子は、核局在化シグナルを認識し、核蛋白質とともに核内に移行することが明らかとなった。一方、97kDa因子は、核局在化シグナルとは結合せず、58kDa因子に結合することによって3者の複合体を核膜孔にまでターゲットする活性を有することがわかった。更に、58kDa因子に対するアフィニティー精製抗体を、生きた培養細胞の細胞質に微小注入すると、同時に注入したSV40T抗原の核局在化シグナルをもつ核蛋白質の核内移行が阻害され、この因子が生きた細胞内で確かに核蛋白質輸送を担うことが証明された。本研究により、核蛋白質輸送の基本的pathwayの分子機構の全容を明らかにする上で重要な足がかりを築くことができ、当初の研究目的は十分に達成できたと考えられる。

核蛋白向细胞核的迁移大致分为依靠基于核电站信号的细胞群至核膜孔的第一步，第二步是使用能量。。研究人员分析了使用体内培养细胞实验和半开膜细胞在第一步中起作用的细胞遗传因素。在体外的实验分析中，核蛋白在细胞质提取中形成稳定的蛋白质复合物，并且该复合物具有该络合物本身与核膜孔结合而无需其他因素。该复合物根据其活性称为“核孔靶向复合物”。构成该复合物的因素得到了完善，并发现其中58kDa和97kDa的因素对于活动至关重要。确定了这两个因素的部分氨基酸序列，并成功进行基因克隆。这些使用重组蛋白的分析表明，58KDA因子识别核定型信号，并转移到带有核蛋白的核蛋白上。另一方面，发现97KDA因子具有通过与58KDA因子结合，将三个复合物靶向核膜孔的活性，而不是与核定型信号结合。此外，最大程度地限制了对活细胞的58KDA因子的亲和力精制抗体，这是核蛋白的核蛋白的核转变，该核蛋白具有核蛋白质的核蛋白质，在SV40T抗原中具有核蛋白质，并在同一时会吸引。这个因素活着。这项研究使得在阐明核蛋白转运基本途径的整个分子机制方面建立重要的立足点，并且已经完全实现了最初的研究目的。