核膜サブドメインを形成する分子基盤と形成機構の解析

核膜亚结构域分子基础及形成机制分析

基本信息

批准号：
19038027
负责人：
今本尚子
金额：
$ 5.31万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

真核生物が進化の過程で獲得した核膜は、遺伝子を封入して遺伝子機能を担う因子群を濃縮するだけでなく、高次クロマチン構築の足場として遺伝子機能を支える細胞内構造である。核膜とクロマチンの物理的・機能的繋がりを探るため、核膜に存在する最も顕著な構造体である核膜孔複合体に注目し、その挙動を調べた。その結果、核膜孔複合体の分布が細胞分裂終期に核膜が形成されるときに定まること、また、その分布がG1初期の細胞運命が決定される時期に崩れること、更に、核膜孔複合体の分布にlaminなどの核内膜因子が積極的に寄与することを明らかにしてきた。細胞機能に即して規則的に変化する核膜上のこの領域を核膜サブドメインと名付けた。膜貫通型の核膜孔複合体因子や異なるサブドメインに局在する核内膜因子の各々に、異なる蛍光タンパク質を付加して同時に2種タンパク質を安定に発現する細胞株を取得し、ライブ観察を行った。その結果、核膜形成初期に核内膜や核膜孔複合体などの因子群が染色体側部にまず集積し、その後、染色体上を局在化することでサブドメインが形成されることを確認した。この過程を生化学的に解析するため、取得した安定発現株の、分裂期のセミインタクト細胞を作成した。そのセミインタクト細胞に細胞抽出液とATPを添加すると、添加した因子に依存して、膜貫通型の核膜因子が染色体側部にターゲットし、更に、染色体上を局在化することがわかった。生細胞で見られる核膜形成初期反応を、in vitroで再構築できたことを示す結果である。蛍光チューブリンを加えると、この再構成では、紡錘体形成も再現され、核膜因子の局在化に関与することを示唆する結果を得ている。この系を利用することにより、核膜形成を担う可溶性因子や核膜因子の局在化機構、並びに、核膜因子を集積させる染色体側要素の、生化学的解析が可能になる。当初の研究目的を十分に達成したと考える。

核膜是真核生物在进化过程中获得的一种细胞内结构，它不仅封装基因并集中负责基因功能的因子，而且作为构建高阶染色质的支架支持基因功能。为了探索核膜和染色质之间的物理和功能联系，我们重点关注核孔复合体（核膜中存在的最突出的结构），并研究了其行为。结果，我们发现核孔复合物的分布是在细胞分裂末期形成核膜时决定的，并且在决定细胞命运的G1早期，这种分布崩溃了。核纤层蛋白等因素积极促进复合体的分布。我们将核膜上的这个区域命名为核膜子域，该区域根据细胞功能定期变化。我们在每个跨膜核孔复合物因子和位于不同子域的核膜因子中添加了不同的荧光蛋白，以获得同时稳定表达两种类型蛋白的细胞系，并进行了活体观察。结果，我们证实，内核膜和核孔复合体等因子在核膜形成的早期阶段首先在染色体两侧积累，然后定位在染色体上形成子结构域。为了对这一过程进行生化分析，我们在获得的稳定表达系的有丝分裂期创建了半完整细胞。当将细胞提取物和ATP添加到半完整细胞中时，发现跨膜核膜因子靶向染色体两侧，并进一步定位在染色体上，具体取决于添加的因子。这些结果表明，在活细胞中观察到的初始核膜形成反应可以在体外重建。当添加荧光微管蛋白时，这种重构也会再现纺锤体形成，表明它参与核膜因子的定位。通过使用该系统，可以对负责核膜形成的可溶性因子和核膜因子以及积累核膜因子的染色体元件的定位机制进行生化分析。我们相信最初的研究目标已经完全实现。