蛋白質の核―細胞質間輸送の可視化

蛋白质核-细胞质运输的可视化

基本信息

批准号：
11242203
负责人：
今本尚子
金额：
$ 46.85万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research (2002-2003)National Institute of Genetics (2000-2001)Osaka University (1999)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

セミインタクト細胞を用いたin vitro輸送系において、輸送反応中のGFP-importinβ(輸送担体)とGST-NLS-GFP(輸送基質)1分子の挙動を、アセンブルした核膜孔複合体上で直接捉えることに成功している。輝点の寿命と蛍光強度の定量的解析より、輸送反応中に分子が核膜孔複合体上に滞在する時間及び1つの核膜孔複合体がimportinβを結合しうる分子数とimportinβに対する結合定数を求めた結果、以下の知見を得た。1)核膜孔複合体上には、importinβに対して数pmolオーダーの極めて強い少数の結合サイトと、およそ70nMオーダーの100〜200の多数の結合サイトが存在する。2)importinβ単独(基質とRan非存在下)では、核膜孔複合体上に短く滞在するもの(約1s)と、長く滞在するもの(約6〜10s)が見られるので、上記1)の両結合サイトと相互作用すると考えられる。3)importinβ/基質複合体(Ran非存在下)は短く滞在するもの(約1s)のみが見られ、核膜孔複合体上の弱い結合サイトのみと相互作用すると考えられる。4)importinβ/基質複合体(Ran存在下)は短く滞在するもの(約1s)と長く滞在するもの(約3s)がみられたが、長い滞在時間はimportinβ単独の滞在時間よりも短かった。1分子解析と同条件下において、輸送担体と輸送基質が核に集積する速度を求めたところ、輸送担体と基質ともに、長い滞在時間と核内集積速度が一致することが判明した。このことから、輸送担体が核膜孔複合体上の強い結合サイトに相互作用することが通過反応に重要であると考えられる。また、Ranの影響で滞在時間の変化が見られることから、強い結合サイトの性質がRanの影響で変化すると予想される。これら一連の結果は、一分子可視化技術を応用して得られた最初の知見であり、研究成果は十分に得られたと思われる。

在使用半完整细胞的体外转运系统中，我们直接捕获了 GFP-importinβ（转运载体）和 GST-NLS-GFP（转运底物）一分子在组装的核孔复合物上的转运反应过程中的行为。已经成功了。通过对亮点的寿命和荧光强度进行定量分析，确定了转运反应过程中分子在核孔复合物上停留的时间、一个核孔复合物可以与importinβ结合的分子数量以及importinβ的结合常数。结果，我们获得了以下知识。 1)在核孔复合体上，存在少量几个pmol数量级的极强的importinβ结合位点和大约70nM数量级的大量100-200个结合位点。 2)单独输入β(在没有底物和Ran的情况下)，一些在核孔复合物上停留较短的时间(大约1秒)，而另一些则停留很长时间(大约6至10秒)。它与两个结合位点相互作用。 3)观察到importinβ/底物复合物(在没有Ran的情况下)仅停留很短的时间(大约1秒)，并且认为它仅与核孔复合物上的弱结合位点相互作用。 4)观察到importinβ/底物复合物(在Ran存在下)停留时间较短(约1s)和较长时间(约3s),但长停留时间比单独的importinβ短。当我们在与单分子分析相同的条件下测定运输载体和运输底物在核中积累的速率时，我们发现运输载体和底物的长停留时间和核积累速率相匹配。这表明转运载体与核孔复合物上的强结合位点的相互作用对于转运反应很重要。此外，由于观察到停留时间由于Ran的影响而变化，因此预计强结合位点的性质在Ran的影响下发生变化。这一系列结果是应用单分子可视化技术获得的第一个发现，看来研究成果已经得到了充分的体现。