核ー細胞質間輸送システムの統合的解析に向けた基盤作り

为核质转运系统的综合分析奠定基础

基本信息

批准号：
22370073
负责人：
今本尚子
金额：
$ 8.57万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

遺伝子機能の場(核)とタンパク質合成の場(細胞質)が2層の核膜で隔てられた真核生物において、核と細胞質の間の情報分子の交換は、細胞の全ての生命活動において必要不可欠である。核へ出入りするタンパク質は数千種と見積もられるが、その多くがヒトでは、21種類のimportin βファミリーに属する運搬体分子によって核膜孔複合体を通して核内外に運ばれる。多種類のimportin βファミリー運搬体分子はその特性の違いに基づき、核内の諸反応に関わる特定のタンパク質グループを適時供給・除去するための輸送システムを構成していると予想されるが、このシステムの全体像を理解するための各importin βファミリー運搬体の基質情報が極めて少ないのが現状である。本研究ではそ未だ情報の少ない各importin βとそれらの輸送基質の対応関係を網羅的に決定する方法の開発を進める。基本原理は、安定同位体標識(SILAC)法と無細胞系輸送構築系を組み合わせ、"functional"アッセイで基質を同定する手法である。本年度は、組換え輸送基質を用いた検討、核内輸送反応の最適条件、反応後の核内タンパク質の抽出方法の設定を行い、実際に安定同位体標識した細胞抽出液を用いて反応させ、質量分析法(LC-MS/MSおよびMALDI-MS/MS)で解析した。Importin βファミリーの1つであるtranportinを用いて得られた結果について詳細な解析を行った。質量分析の解析で得られた上位候補分子を、生化学的に解析したところ、これまで報告されていなかった分子種も含め、10～20種類のタンパク質を基質として同定することに成功した。今後、バイオインフォマティクスの情報も取り入れ、この同定系の有用性を先ず証明していきたいと考えている。

在真核生物中，基因功能位点（细胞核）和蛋白质合成位点（细胞质）被两层核膜隔开，细胞核和细胞质之间的信息分子交换是细胞所有生命活动所必需的。基本的。据估计，有数千种蛋白质进出细胞核，而在人类中，这些蛋白质中的大多数是通过属于输入蛋白β家族的21种转运蛋白分子通过核孔复合体转运进出细胞核的。基于其性质的差异，多种类型的输入β家族转运蛋白分子有望构成一个转运系统，及时供应和清除参与细胞核内各种反应的特定蛋白基团，目前的信息还很少。对每个输入β家族转运蛋白的底物进行观察，以了解系统的整体情况。在本研究中，我们将开发一种方法来全面确定每个输入蛋白β与其转运底物之间的对应关系，但目前对此的信息还很少。其基本原理是将稳定同位素标记 (SILAC) 和无细胞递送系统相结合，以在“功能”测定中识别底物。今年，我们使用重组转运底物进行了研究，建立了核转运反应的最佳条件，并建立了反应后提取核蛋白的方法，并进行了质谱分析（LC-MS/MS和MALDI-MS/MS）。。我们对使用转运蛋白（导入蛋白 β 家族的成员）获得的结果进行了详细分析。当他们对通过质谱分析获得的顶级候选分子进行生化分析时，他们成功地鉴定出了 10 至 20 种蛋白质作为底物，其中包括以前从未报道过的分子种类。未来，我们希望结合生物信息学的信息，首先证明这个识别系统的有用性。