Regulation mechanism of apoptosis-inducing death receptor localization allowing for survival in tumor cells

凋亡诱导死亡受体定位的调节机制允许肿瘤细胞存活

• 批准号: 19K07648
• 负责人: 小島 裕子
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Juntendo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K07648/
• 关键词: 腫瘍細胞; 細胞死; DR5; 局在; 細胞膜; 核; ゴルジ装置; 細胞内輸送; タンパク質発現調節; TRAIL; DR5 localization; TRAIL-resistant tumor; Importin β1 inhibition; Agonistic antibody; Cancer therapy; 局在制御; アポトーシス; 分子標的がん治療; 腫瘍細胞; 細胞死; DR5; 局在; 細胞膜; 核; ゴルジ装置; 細胞内輸送; タンパク質発現調節; TRAIL; DR5 localization; TRAIL-resistant tumor; Importin β1 inhibition; Agonistic antibody; Cancer therapy; 局在制御; アポトーシス; 分子標的がん治療

リガンドであるTRAIL分子と、細胞膜上で結合して細胞死を誘導するDR5タンパク質が、TRAIL耐性腫瘍細胞内では細胞膜より核に大量に局在するこれまでの実験事実を元に、DR5の局在を制御して細胞膜での発現を高めて、腫瘍細胞に対して広く細胞死誘導を可能にする機能分子を探索する目的で、バーコード化された約6,500種類のヒトタンパク質に対する約55,000種類のshRNAを含む、ヒトゲノムワイドshRNAライブラリーのモジュール#2（標的遺伝子：疾患関連遺伝子、薬剤標的遺伝子）を用いた。HEK293Tで調整した偽ウイルス粒子を、単なるTRAIL低感受性HeLa細胞株ではなく、HeLa細胞株にdeath domain欠損GFP-DR5を予め遺伝子移入した細胞に感染させてshRNAを遺伝子導入した。shRNAの選択薬剤であるDoxycyclineとGFP-DR5の選択薬剤であるG418共存下で培養、細胞膜に発現するDR5をPacific blue標識抗体で蛍光標識し、shRNAと共に遺伝子導入したTagRFP発現細胞で且つGFP発現細胞の中で、親株の細胞よりも細胞膜のDR5発現が高い細胞集団（DR5 high）をFACSでソートした。初回ソートでDR5 highはわずか0.7%だったが、5回目のソートで約50%に濃縮された。この細胞集団のコントロールとして、同様に遺伝子導入を行い、TagRFP陽性細胞で細胞膜DR5の発現が低い約80%の細胞をソートした。これらの細胞をレーザー顕微鏡で観察すると、GFP-DR5の蛍光がDR5 high の細胞では核に観察されず、ER領域と細胞膜に極めて明るく検出された。 一方、コントロール細胞は、主に核にGFP-DR5が観察され、細胞質や細胞膜の発現は弱く、ER領域の集積は認められなかった。そこで、これら２種類の細胞集団の遺伝子受託解析を依頼する。

Based on previous experimental facts in which the ligand TRAIL molecule and the DR5 protein that binds to the cell membrane to induce cell death are localized in large numbers in TRAIL-resistant tumor cells in the nucleus than the cell membrane, we used Module #2 (target genes: disease-related genes, drug target genes) of the human genome-wide shRNA library containing approximately 55,000 types of shRNA for approximately 6,500 types of human蛋白质的目的是寻找调节DR5定位的功能分子，增加细胞膜中的表达，并允许对细胞死亡的广泛诱导对肿瘤细胞。用HEK293T调节的假病毒颗粒被先前被引入具有死亡域缺陷型GFP-DR5的细胞感染，而不是简单地传递了径向敏感的HeLa细胞系，以转移shRNA。在存在强力霉素的存在下表达的细胞群（DR5高），SHRNA的选择性剂，G418（G418）是GFP-DR5的选择性剂，用太平洋蓝色标记的抗体进行荧光标记，并用TAGRFP表达的细胞（在shRNA和GFP表达的细胞中）在较高的细胞中（DR5）（DR5）（DR5）（DR5）（DR5）（DR5）（DR5）（DR5）（DR5）较高的细胞（DR5）（DR5）（DR5）。父母线的细胞由FACS分类。 DR5高的最初仅为0.7％，但第五种集中到约50％。基因转移的方式与该细胞群体的对照方式相同，在TAGRFP阳性细胞中对低细胞膜DR5表达的细胞进行了约80％的细胞。当在激光显微镜下观察到这些细胞时，在DR5高细胞中的细胞核中未观察到GFP-DR5的荧光，而是在ER区域和细胞膜中非常明亮地检测到。另一方面，主要在对照细胞中的细胞核中观察到GFP-DR5，细胞质和细胞膜表达弱，并且没有观察到ER区域的积累。因此，我们要求对这两个细胞种群进行基因委员会分析​​。